安徽地區(qū)腹瀉病人糞便標(biāo)本中沙門菌分離及其血清型鑒定

方 欣，李 春

安徽地區(qū)腹瀉病人糞便標(biāo)本中沙門菌分離及其血清型鑒定

方 欣1，李 春2

目的 了解安徽地區(qū)近期臨床分離沙門菌血清型、藥物敏感性、毒力基因攜帶及血清型相同菌株的基因溯源情況。方法 應(yīng)用血清凝集法檢測(cè)沙門菌的血清型，微量肉湯稀釋法檢測(cè)藥物敏感性，PCR法擴(kuò)增毒力基因，PFGE法檢測(cè)基因同源性并進(jìn)行溯源。結(jié)果 43株沙門菌中鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌分別占(39.5%/29.6%)。43株菌對(duì)四環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、萘啶酸和氯霉素的耐藥率分別為(60.5%/39.5%/37.2%/30.2%)，43株菌均攜帶InvA和InvE毒力基因，鼠傷寒沙門菌基因同源性較低，腸炎沙門菌基因同源性較高。結(jié)論 本次安徽地區(qū)臨床分離的沙門菌以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主，其他血清型散在分布。對(duì)常規(guī)抗生素呈較高的耐藥性，分離菌株均攜帶毒力基因?qū)θ梭w具有致病性。本地區(qū)流行的鼠傷寒沙門菌大部分來(lái)源于不同的基因克隆株，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而流行的腸炎沙門菌大部分來(lái)源于同一克隆株或親緣關(guān)系較近的克隆群體。

沙門菌；血清型；毒力基因；基因同源性

沙門菌病是一種重要的人獸共患病，其菌屬型別繁多，抗原復(fù)雜，目前已鑒定的血清型達(dá)2 500多種，是引起食源性腹瀉的重要病原菌之一。世界衛(wèi)生組織證實(shí)沙門菌病是當(dāng)前重新出現(xiàn)的重要傳染病之一，全球每年約有1 600萬(wàn)沙門菌感染病例[1]。2007年發(fā)生的“花生醬事件”和2008年發(fā)生的“西紅柿”事件，引發(fā)這些事件的真正元兇正是這種極為常見的病原菌——沙門菌。在我國(guó)，沙門菌也是引起食物中毒最常見的病原菌之一。

本文為調(diào)查本地區(qū)腹瀉病人糞便中分離沙門菌的血清型分布、主要毒力基因攜帶情況、常用抗生素的敏感性及主要流行株的克隆分布，為疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 2013年安徽地區(qū)從臨床腹瀉病人糞便中分離出沙門菌43株，其中安徽省兒童醫(yī)院18株，寧國(guó)市人民醫(yī)院15株，馬鞍山市中心醫(yī)院5株，馬鞍山市第二人民醫(yī)院3株，馬鞍山市第四人民醫(yī)院2株。所有菌株均經(jīng)VITEK-2 compact鑒定。

1.2 主要試劑和儀器 沙門菌血清診斷試劑盒購(gòu)自丹麥，PCR反應(yīng)體系購(gòu)自美國(guó)promega公司，XbaI購(gòu)自大連寶生物，Sensitire藥敏板購(gòu)自Thermo公司，PCR擴(kuò)增儀 PTC-200為美國(guó)MJ公司產(chǎn)品，CHEF MAPPER、凝膠成像儀Gel-DocXR為Bio-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 血清分型試驗(yàn) 采用玻片凝集法分別進(jìn)行O抗原與H抗原檢測(cè)，查表獲得沙門菌屬相應(yīng)的血清型。

1.4 藥物敏感性試驗(yàn) 用生理鹽水將待測(cè)菌調(diào)制成0.5 MCF濁度，取10 μL加入11 mL的肉湯管中混勻，取50 μL混勻后的肉湯菌懸液加入藥敏板中，37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.5 沙門菌毒力基因檢測(cè) PCR檢測(cè)所用模板采用煮沸法，引物由中國(guó)CDC傳染病所設(shè)計(jì)，上海生工合成，IvnA-F: 5′-AACTTTATTGGCGGTATTTC-3′, IvnA-R: 5′-CGTAACAACCAATACAAATG-3′; IvnE-F: 5′-GGCGGAAGTACAGAAATTTG-3′, IvnE-R: 5′-ACGTTGGTAGCCATAACTGG-3′。PCR擴(kuò)增程序：IvnA 94℃ 5 min,(94 ℃ 45 s,52℃ 45 s,72℃ 60 s)35,72℃ 10 min; IvnE 94 ℃ 5 min,(94 ℃ 45 s,50 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s)35,72℃ 10 min。

1.6 沙門菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型 選擇血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果同型的鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌進(jìn)行PFGE分型。實(shí)驗(yàn)方法和參數(shù)參照TraNet china指導(dǎo)手冊(cè)和相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]。操作步驟：首先用CSB溶液將試驗(yàn)菌調(diào)制成4.0～4.5 OD值的菌懸液制備小膠條；室溫冷卻15 min后將小膠條放入CLB溶液中裂解1 h；然后用去離子水洗2次，TE洗4次；再用XbaI酶切2 h,棄去酶切液，用0.5×TBE緩沖，逐個(gè)取出小膠條用梳齒粘貼上樣法制備1%大膠塊，接著電泳、染色、拍照和分析結(jié)果。電泳參數(shù)是：溫度14 ℃，電壓6.0 V,夾角120°，線性梯度變化2.16 s～63.80 s，電泳時(shí)間18 h；Bionumberics 6.6cn分析電泳圖譜。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌血清型分布 在分離的43株沙門菌中：鼠傷寒沙門菌17株，腸炎沙門菌11株，辛川沙門菌2株，布倫登盧普沙門菌2株，德爾卑沙門菌2株，傷寒沙門菌1株，甲、乙型副傷寒各1株，湯卜遜沙門菌、利物浦沙門菌、達(dá)布沙門菌、豬霍亂沙門菌、伊斯特本沙門菌、阿伯丁沙門菌各1株。

2.2 藥敏試驗(yàn) 43株沙門菌對(duì)大部分抗生素均較敏感，其中對(duì)環(huán)丙沙星和頭孢西丁高度敏感，對(duì)四環(huán)素、奈丁酸和甲氧芐啶/磺胺甲噁唑耐藥率較高，見表1。

2.3 沙門菌毒力基因檢測(cè) 43株沙門菌PCR檢測(cè)全部攜帶InvA和InvE毒力基因。部分菌株電泳圖見圖1。

表1 43株沙門菌對(duì)8種抗生素的敏感性檢測(cè)結(jié)果

圖1 部分Inv-A、Inv-E基因電泳圖

2.4 17株鼠傷寒沙門菌和11株腸炎沙門菌PFGE分型 血清型相同的17株鼠傷寒沙門菌中基因型100%同源的有2組，共4株菌；同源性96.6%有2組，共4株菌；同源性96%有1組，共3株菌(其中2株100%同源)。其余菌株同源性較低。

血清型相同的11株腸炎沙門菌中基因型100%同源的有3組，共8株菌；同源性96.3%有1組，共5株菌(其中的2株100%同源，另外3株100%同源)；同源性96%有1組，共2株菌。其余菌株同源性較低。

PFGE電泳圖見圖2～3，Bionumberics 6.6cn分析結(jié)果見圖4～5。

圖2 17株鼠傷寒沙門菌PFGE電泳圖

圖3 11株腸炎沙門菌PFGE

Fig.3 PFGE electrophoresis of 11 strains ofSalmonellaenteritidis

3 討 論

本次檢測(cè)的43株沙門菌來(lái)自全省的5家醫(yī)院，以安徽省兒童醫(yī)院和寧國(guó)市人民醫(yī)院為主，血清學(xué)分型結(jié)果顯示以鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌為主，其他血清型散在分布。本次檢測(cè)結(jié)果與國(guó)內(nèi)多個(gè)地區(qū)報(bào)道的流行情況近似[5-8]。藥敏結(jié)果顯示43株沙門菌對(duì)慶大霉素、環(huán)丙沙星和頭孢菌素類較敏感，對(duì)四環(huán)素、奈丁酸、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑和氯霉素呈現(xiàn)較高的耐藥性。國(guó)內(nèi)外也報(bào)道了沙門菌對(duì)上述幾種抗生素較高的耐藥情況[6,8-11]。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示本次臨床分離的43株沙門菌均攜帶InvA和InvE毒力基因，提示這43株沙門菌對(duì)人體均具有較強(qiáng)的致病性，在正常人群中不會(huì)攜帶。

圖4 17株鼠傷寒沙門菌聚類圖譜

圖5 11株腸炎沙門菌聚類圖譜

本次PFGE分子分型試驗(yàn)的17株鼠傷寒沙門菌中有8株分離自安徽省兒童醫(yī)院，6株分離自寧國(guó)市人民醫(yī)院，其余3株分別分離自馬鞍山市中心醫(yī)院、馬鞍山市第二人民醫(yī)院和馬鞍山市第四人民醫(yī)院。分析結(jié)果提示：僅有2組100%同源，只有其中1組共2株菌分離自同一家醫(yī)院，另外1組的2株菌分離自不同地區(qū)的兩家醫(yī)院。同源性達(dá)96%以上的各組菌株均分離自不同的醫(yī)院。其余菌株之間同源性較低。以上論述提示2013年在安徽不同地區(qū)感染的鼠傷寒沙門菌同源性較低，就是在同一地區(qū)同一家醫(yī)院分離的鼠傷寒沙門菌同源性同樣也較低。因此可以推斷出：在以上這些地區(qū)感染的鼠傷寒沙門菌是來(lái)自不同的克隆株，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本次PFGE分子分型試驗(yàn)的11株腸炎沙門菌中有5株分離自寧國(guó)市人民醫(yī)院，4株分離自安徽省兒童醫(yī)院，其余2株分別分離自馬鞍山市中心醫(yī)院和馬鞍山市第二人民醫(yī)院。分析結(jié)果提示：100%同源的總共有3組，各組中的菌株有分離自同一家醫(yī)院的，也有同一地區(qū)不同醫(yī)院的。同源性達(dá)96%以上的各組中有分離自同一家醫(yī)院的，也有分離自不同地區(qū)醫(yī)院的。以上論述提示，2013年在安徽省同一地區(qū)感染的腸炎沙門菌存在較高的同源性，此外在不同地區(qū)間感染的腸炎沙門菌也存在較高的同源性。因此可以推斷出：在以上地區(qū)感染的腸炎沙門菌大部分來(lái)自同一克隆株或是親緣關(guān)系較近的克隆群體。

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Isolation and serotype identification ofSalmonellain feces of diarrhea patients in Anhui Province, China

FANG Xin1,LI Chun2

(1.AnhuiMedicalCollege,Hefei230601,China)2.AnhuiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Hefei230601,China)

We investigated the serotype, drug sensitivity, virulence gene and gene traceability ofSalmonellaisolated from the clinical in Anhui Province, which could provide the reference data for epidemiology of diarrhea caused bySalmonella. Serum agglutination was used to detectSalmonellaserotype; drug sensitivity was tested by broth microdilution method; PCR was used for virulence gene and PFGE for gene homology and traceability.SalmonellatyphimuriumandSalmonellaenteritidiswere 39.5% and 29.6% respectively in 43Salmonella, the isolates were resistant to tetracycline, trimethoprim / sulfamethoxazole, chloramphenicol, and nalidixic acid, and the resistance rate were 60.5%, 39.5%, 37.2% and 30.2%, respectively. The isolates were all carrying InvA and InvE virulence genes. The gene homology was low inSalmonellatyphimurium, which was high in Salmonella enteritidis. The major serotypes wereSalmonellatyphimuriumandSalmonellaenteritidisofSalmonellaisolated from clinical in Anhui area. The isolates were resistant to commonly used antibiotics and carried virulence genes. The local prevalence ofSalmonellatyphimuriumwas mostly from different gene clones, which were not closely related. The otherSalmonellaenteritidismostly derived from the same clone or the clone with a closer relationship.

Salmonella; serotype; virulence gene; gene homology

LI Chun,Email:lichun0218@126.com

李春,Email:lichun0218@126.com

1.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，合肥 230601; 2.安徽省疾病預(yù)防控制中心，合肥 230601

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.009

R378

A

1002-2694(2015)02-0135-04

2014-08-17；

2014-12-22