豬源腸外致病性大腸桿菌的分離與鑒定

馬增軍，芮 萍，逯春香，楊彩然，劉謝榮，王秋悅，劉曜綜，張建文

豬源腸外致病性大腸桿菌的分離與鑒定

馬增軍，芮 萍，逯春香，楊彩然，劉謝榮，王秋悅，劉曜綜，張建文

目的 檢測豬源腸外致病性大腸桿菌(ExPEC)的血清型與毒力基因。方法 對2013-2014年間秦皇島地區(qū)30 份組織病料采用細菌形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性試驗、生化試驗鑒定出8株腸外致病性大腸桿菌。采用玻片凝集法測定這些大腸桿菌病的血清型，并用PCR擴增法檢測9種毒力基因。結(jié)果 定型菌株5株，分別屬于O53、O93和 O157 3個血清型，9 種毒力基因 PCR 檢測結(jié)果表明ler、iutA、irp2、fyuA、astA 5種基因檢出率分別為100%、75.0%、50.0%、50.0%、25.0%。結(jié)論 所檢測的豬源腸外致病性大腸桿菌以O(shè)53、O93 和O157 為主要流行血清型，同時攜帶fyuA、ler和iutA基因的菌株致病性較強。

腸外致病性大腸桿菌；血清型；毒力基因；豬

Supported by the Hebei Science and Technology Support Program (No. 13826616D), the Program for Hundred Excellent Talents in Hebei University (2012), and the Special Scientific Research Fund to Pig Industry System in Hebei Province (2013)

大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界，并能引起人和動物共同感染的重要人獸共患病病原。根據(jù)豬的日齡、生理與免疫狀況等差異，常見的豬大腸桿菌病主要分為仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病，發(fā)病機制與危害已被人們廣泛認識。近幾年，北美和歐洲許多學(xué)者相繼報道了可特定定殖于宿主腸道外其他組織，并嚴重致病的一類新的大腸桿菌菌群——腸外致病性大腸桿菌(extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，EPEC)。腸外致病性大腸桿菌是一類能引起人和動物腸外組織感染的重要人獸共患病病原，可致使不同宿主發(fā)生腦膜炎、敗血癥、泌尿道感染和呼吸道感染，已引起全世界的廣泛關(guān)注[1-3]。

近年來，規(guī)模豬場隨著豬呼吸與繁殖綜合征、圓環(huán)病毒病、豬瘟、偽狂犬病毒等免疫抑制性疾病的發(fā)生，豬鏈球菌、巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌等繼發(fā)感染和混合感染也多見[4-6]。2014年4月，送檢病例豬發(fā)生以高熱綜合征、敗血癥、腹瀉為主要臨床癥狀。通過細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清型檢定、毒力基因檢測及小鼠致病性試驗證實為腸外致病性大腸桿菌感染引起，為預(yù)防和控制該病流行提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源 2013年12月-2014年4月，無菌采集具有高熱癥狀瀕死豬的肺臟、腎臟、脾臟、肝臟等共30份病料進行細菌的分離鑒定。

1.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker均購自寶生物(大連)有限公司。標(biāo)準大腸桿菌O抗原定型血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。自動生化鑒定系統(tǒng)ID32E鑒定試劑條(法國梅里埃公司產(chǎn)品)。

1.3 病原分離純化 無菌采取疑似大腸桿菌病料肝、脾、肺、腎等器官組織，分別劃線接種于MC培養(yǎng)基、7%家兔脫纖血瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，挑取圓形、不透明、直徑2～3 mm的粉紅色可疑菌落移接于普通營養(yǎng)瓊脂斜面置37 ℃培養(yǎng)16～24 h做純培養(yǎng)后，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分離菌形態(tài)特征及理化特性鑒定 無菌挑取上述純培養(yǎng)菌，經(jīng)革蘭染色鏡檢。將分離細菌的純培養(yǎng)物分別接種于SS培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。將可疑菌落做TSI、氧化酶試驗后，用自動生化鑒定系統(tǒng)ID32E鑒定試劑條進行鑒定。

1.5 O抗原血清型鑒定 取典型菌落接種于普通瓊脂斜面小管，置37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用0.5%石炭酸生理鹽水2 mL將菌苔洗下，置小圓底試管中用塞子塞住，制成濃稠菌懸液，經(jīng)過121 ℃高壓2 h，破壞其K抗原。冷卻后用14種標(biāo)準單因子血清進行玻板凝集反應(yīng)，同時以O(shè)抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象。如0.5 min內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)。

1.6 毒力基因檢測

1.6.1 引物設(shè)計 按GenBank公布的基因序列，參照文獻[7-8]中有關(guān)致病性大腸桿菌的9個毒力基因iutA、papC、afa、fyuA、astA、escV、eaeA、ler、irp2共設(shè)計9對引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1所示。

表1 致病性大腸桿菌相關(guān)毒力基因的擴增引物和擴增條件

1.6.1.2 PCR檢測 用LB肉湯37 ℃培養(yǎng)12 h的細菌用滅菌生理鹽水8 000 r/min洗滌2次后，再用生理鹽水稀釋為原菌液體積作為細菌DNA模板。反應(yīng)體系(25 μL)為10×緩沖液 2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.5 μL，Taq酶0.25 μL，菌液1.0 μL，滅菌ddH2O 18.25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 預(yù)變性10 min；進入 PCR 循環(huán)，94 ℃1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后，72 ℃延伸8 min后結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證。

1.7 小鼠致病性試驗 將45只小白鼠隨機分成9組，1～8組為試驗組，分別用1-8號分離菌株接種營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h，分別腹腔注射小白鼠5只，0.1 mL/只(約含菌(2.4～3.0)×108CFU/mL)。同時設(shè)對照鼠5只，每只腹腔注入新鮮肉湯0.1 mL。接種后觀察發(fā)病及死亡情況并剖檢觀察，無菌取其肝、肺分離細菌并鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察 鏡檢可見分離菌株為革蘭氏陰性、短小的桿菌。分離的細菌在麥康凱培養(yǎng)基上均呈粉紅色、邊緣整齊、表面光滑濕潤的菌落；在血瓊脂上形態(tài)多樣，主要有灰色、中心偏白、光滑菌落，均不溶血；在SS培養(yǎng)基上不生長；在伊紅美蘭瓊脂上為黑色或棕綠色有金屬反光、光滑菌落。

2.2 生化試驗 8株分離菌V-P試驗均為陰性，均可分解葡萄糖和乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，不產(chǎn)生H2S，且均有動力。經(jīng)自動生化鑒定系統(tǒng)檢測，鑒定結(jié)果為大腸埃希菌，見表2。

2.3 血清型試驗 玻片凝集試驗顯示從8株腸外致病性大腸桿菌中鑒定2株O53，1株O93，2株O157，定型菌株占的62.5%。

2.4 毒力基因檢測 對8株ExPEC進行了9種毒力基因的PCR檢測、測序鑒定以驗證毒力基因，檢測結(jié)果見表3。ler、iutA、irp2、fyuA、astA 5種基因檢出率分別為100%、75.0%、50.0%、50.0%、25.0%，所有菌株都沒有擴增出afa、escV、papC、eaeA目的條帶。

表2 8株大腸桿菌毒力基因檢測結(jié)果

注：“+” 表示有目的條帶，“-”表示無目的條帶。

Note: “+” target band, “-” no band.

2.5 小鼠致病性試驗 試驗組小白鼠于6～48 h內(nèi)全部發(fā)病死亡，其中1-4號菌株所接種小白鼠于8 h內(nèi)死亡。7、8號菌株所接種小白鼠于12 h內(nèi)死亡。5、6號菌株所接種小白鼠于36～48 h內(nèi)死亡。發(fā)病小鼠主要癥狀為行動減少、顫抖、精神不振，急性死亡小鼠剖檢結(jié)果主要為內(nèi)臟充血和出血明顯，個別脾臟腫大。慢性死亡小鼠胸腔積液和心包積液，腸壁變薄，腸粘膜脫落。無菌采集死亡小白鼠肝臟、肺臟接種于麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)18 h后分離獲得純一的病原細菌。挑取單個菌落革蘭染色后鏡檢，可見于接種菌一致的病原細菌。對照組2只小白鼠健康存活。致病性試驗顯示：同時攜帶iutA基因、耶爾森菌HPI毒力島fyuA基因和LEE毒力島ler基因的菌株致病性最強，攻毒小鼠于8 h之內(nèi)發(fā)病死亡。

3 討 論

從4個豬場中具有高熱綜合征病豬的8份病料中分離出8株致病性大腸桿菌，其中定型菌株5株,分別屬于O53、O93和 O157 3個血清型。同一豬場的同一頭豬的不同部位(肺、肝、腎、脾)能同時分離出ExPEC，且分離到不同血清型的ExPEC，可見豬ExPEC流行廣，病原復(fù)雜。9 種毒力基因 PCR 檢測結(jié)果表明ler、iutA、irp2、fyuA、astA 5種基因檢出率較高，分別為100%、75.0%、50.0%、50.0%、25.0%。致病性試驗顯示8株分離菌對小白鼠均具有較強致病性。

表3 分離菌株的生化特性

注：“+”陽性，“-”陰性

Note： “+” positive，“-”negative

O抗原血清型鑒定結(jié)果顯示，在被檢的8份致病性大腸桿菌中，共檢測出3種血清型O53、O93、O157。其中O157、O93作為致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型在我國多見報道[9-10]。O53作為致病性大腸桿菌的優(yōu)勢血清型未見報道，但本試驗從同一頭豬不同組織分離到純一的大腸桿菌，且表現(xiàn)為不同血清型分別為O53和O157，說明O53 可能是流行的致病性血清型，并可能是引起豬高熱綜合癥和高死亡率的主要血清型。另有3株未能定型，是否屬于所測14種O抗原血清型之外或是新流行的血清型尚待研究。

ExPEC之所以有其特殊的組織靶標(biāo)，與它具備特殊的毒力因子(VFs)密不可分的。包括菌毛編碼基因：pap、sfa/foc、afa/dra分別參與了 P菌毛、S菌毛和Dr家族菌毛的合成；iutA為螯鐵蛋白受體，屬于鐵攝取系統(tǒng)[11]。熱穩(wěn)定腸毒素 astA(EAST1)最早在腸粘附性E.coli(EAEC) 中發(fā)現(xiàn)有很高的檢出率，后來研究發(fā)現(xiàn)其他一些E.coli同樣攜帶該基因[12]。耶爾森氏菌強毒力島(HPI)可在耶爾森氏菌和大腸桿菌之間水平傳播[13]，與致病性大腸桿菌的毒力進化密切相關(guān)，fyuA和 irp2基因是HPI核心區(qū)的主要結(jié)構(gòu)基因。本研究檢出結(jié)果顯示秦皇島地區(qū)規(guī)模化豬場流行的ExPEC 5種毒力基因ler 、iutA、fyuA、irp2、astA 的檢出率分別為100%、75.0%、50.0%、50.0%、25.0%。結(jié)合小鼠致病性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8株試驗菌株對小白鼠均有不同程度致病性，尤其指出同時攜帶iutA基因、耶爾森菌HPI毒力島fyuA基因和LEE毒力島ler基因的菌株致病性最強，該類菌對豬群健康具有潛在性的威脅，應(yīng)引起高度重視。

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Isolation and identification of extraintestinal pathogenicEscherichiacolifrom swine

MA Zeng-jun,RUI Ping,LU Chun-xiang,YANG Cai-ran,LIU Xie-rong,WANG Qiu-yue,LIU Yao-zong,ZHANG Jian-wen

(KeyLaboratoryofPreventiveVeterinaryMedicineofHebei,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Changli066600,China)

To investigate the serotypes and virulence genes of extraintestinal pathogenicEscherichiacoli(ExPEC) in Qinhuangdao City, China, a total of 30 tissue samples were collected from pigs during 2013 to 2014 and 8 isolates of ExPEC were isolated which were identified by colony morphology, culture characteristics identification, and biochemical observation. The O serogroups were identified by agglutination with specific antisera. All strains were screened for virulence genes by PCR. Three O serogroups were identified for 5E.coliisolates, of which O53, O93 and O157 were dominant serogroups. In addition, the virulence genes were detected by PCR and the results showed that ler, iutA, irp2, fyuA, and astA were positive in the 8 isolates by 100%, 75.0%, 50.0%, 50.0%, and 25.0%, respectively. It is concluded that O53, O93 and O157 are dominant serogroups associate with the disease of swine. Isolates carrying pathogenicity islands geneirp2,fyuAandlerwere proved to be pathogenic to mice.

extraintestinal pathogenicEscherichiacoli; serogroups; virulence genes; pig

河北科技師范學(xué)院動科院 河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，昌黎 066600 Email：mzj6699@126.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.008

R378

A

1002-2694(2015)02-0130-05

2014-08-05；

2014-11-24

河北科技計劃項目(No.13826616D)和河北省高校百名優(yōu)秀創(chuàng)新人才支持計劃2012、河北省生豬產(chǎn)業(yè)體系專項資金2013資助