PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌持留性的調(diào)控機(jī)制研究

鄔 博,雷 英,吳 芳,章 樂,吳江東,曹旭東,朱 彬,何 麗 ,李瑞山張玉清,王 釗,王 君,柳小玲,張培培,梁 粟,張萬江

PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌持留性的調(diào)控機(jī)制研究

鄔 博1,雷 英2,吳 芳1,章 樂1,吳江東1,曹旭東1,朱 彬1,何 麗1,李瑞山1張玉清1,王 釗1,王 君1,柳小玲1,張培培1,梁 粟1,張萬江1

目的 本研究通過誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌在低氧環(huán)境中進(jìn)入持留狀態(tài)，來比較分析不同時(shí)間不同低氧環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌中的PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平差異，探討研究PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌持留性的調(diào)控機(jī)制。方法 首先對結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)無毒株(H37Ra)和結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(H37Rv)在不同低氧環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，提取每個(gè)樣本菌株的總RNA，并進(jìn)行完整性鑒定；運(yùn)用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測每個(gè)樣本菌株中PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平；比較分析不同時(shí)間不同低氧環(huán)境下的結(jié)核分枝桿菌菌株P(guān)hoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平差異。結(jié)果 在不同時(shí)間點(diǎn)對低氧環(huán)境的結(jié)核分枝桿菌PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：與第10 d相比，培養(yǎng)至第15 d時(shí)H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且培養(yǎng)至第25 d時(shí)，H37Rv菌株中的PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平比H37Ra菌株表達(dá)均上調(diào)2.34倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 在不同時(shí)間點(diǎn)相同毒力的結(jié)核分枝桿菌的PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中PhoP基因和PhoR基因在不同低氧環(huán)境下的表達(dá)存在差異，而且在相同時(shí)間點(diǎn)不同毒力結(jié)核分枝桿菌的PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中PhoP基因和PhoR基因在不同低氧環(huán)境下的表達(dá)也存在差異，表明PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌的持留性具有調(diào)控作用。

結(jié)核分枝桿菌；持留性；PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)是引發(fā)結(jié)核病(tuberculosis, TB)的主要病原菌，其潛伏感染是導(dǎo)致活動(dòng)性結(jié)核病的主要原因。因此對結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的研究有助于降低活動(dòng)性結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率。有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后大部分細(xì)菌能被機(jī)體清除，僅有少數(shù)細(xì)菌能夠在機(jī)體內(nèi)以一種非增殖的狀態(tài)持久存在，并且這部分細(xì)菌對各種化療藥物不敏感[1-2]，使用抗結(jié)核藥物并不能殺死這部分持留菌。因此認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌的持留性能夠使細(xì)菌在逆境中在組織內(nèi)保持穩(wěn)定和對環(huán)境的無反應(yīng)性[3]，該特性是導(dǎo)致結(jié)核病具有潛伏性的原因。

目前對結(jié)核分枝桿菌的持留性研究發(fā)現(xiàn)，部分細(xì)菌受到某些環(huán)境因子刺激后能夠誘導(dǎo)表達(dá)促使其持留的相關(guān)基因[4]，并且在惡劣的生存環(huán)境中結(jié)核分枝桿菌能夠通過調(diào)控這些持留相關(guān)的基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)其在宿主體內(nèi)持留。但是目前對結(jié)核分枝桿菌在惡劣環(huán)境中是如何調(diào)控這些持留相關(guān)基因表達(dá)的仍然未被闡明。而結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化的系統(tǒng)，能夠調(diào)控細(xì)菌自身的相關(guān)靶基因的表達(dá)，促使其適應(yīng)宿主體內(nèi)微環(huán)境的變化以達(dá)到持久存留在宿主體內(nèi)的目的[5]。因此本研究通過在低氧環(huán)境中誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入持留狀態(tài)，來分析在不同低氧持留狀態(tài)下結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中PhoP基因和PhoR基因在結(jié)核分枝桿菌中的表達(dá)水平差異，進(jìn)而揭示該系統(tǒng)是否對結(jié)核分枝桿菌持留性具有調(diào)控作用，并且進(jìn)一步探討了毒力差異是否對細(xì)菌的持留性的調(diào)控存在影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 結(jié)核桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株(H37Rv)和結(jié)核桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)無毒株(H37Ra)均來源于中國食品藥品檢定研究院，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要儀器與試劑 SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國 Bio-Rad公司)，Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國MDC公司)，細(xì)菌RNA提取試劑盒RNeasy Plus Universal Midi Kit(德國QIAGEN公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(加拿大Fermentas公司)，熒光定量試劑盒QuantiFast SYBR Green PCR Kit(上海凱杰生物技術(shù)有限公司)，中性羅氏培養(yǎng)管(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)，Lysozyme、蛋白酶K均購自北京索萊寶科技有限公司，Goldview I核酸染料購自北京中生瑞泰科技有限公司，氯仿、無RNase酶槍頭及離心管購自上海生物工程有限公司，無水乙醇購自山東濰坊金凱利華有限公司。

1.2 方法

1.2.1 結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)及體外低氧誘導(dǎo)[6]本實(shí)驗(yàn)所使用H37Rv和H37Ra菌株已由實(shí)驗(yàn)室前期鑒定完成。將保存的H37Rv和H37Ra菌株分別接種到改良的羅氏固體培養(yǎng)基上，并在37 ℃恒溫孵育箱孵育3～4周。挑取生長狀態(tài)良好、菌落形態(tài)完整的菌落制備成菌懸液接種到7H9液體培養(yǎng)基中，并將其置于37 ℃恒溫孵育箱培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600～0.4)。然后將培養(yǎng)物稀釋為OD600～0.1，并取5 mL稀釋的培養(yǎng)物分裝在含有15 mL 7H9新鮮培養(yǎng)基的試管中(試管口不密封)，然后將試管置于含有5% CO2和5% O2的有氧環(huán)境[7]中37 ℃培養(yǎng)。另取5 mL稀釋的培養(yǎng)物分裝在15 mL 7H9新鮮培養(yǎng)基的試管中，擰緊試管蓋并用封口膜密封試管口，然后將試管置于密閉性優(yōu)良的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，并在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)( 5 d、10 d、15 d、20 d、25 d)分別取不同低氧環(huán)境中的細(xì)菌均勻接種在中性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)并在37 ℃培養(yǎng)并觀察有無菌落生長。同時(shí)收集不同時(shí)間點(diǎn)的各樣本菌株抽提細(xì)菌總RNA。

1.2.2 結(jié)核分枝桿菌計(jì)數(shù) 將分別培養(yǎng)了5 d、10 d、15 d、20 d、25 d的各樣本菌株進(jìn)行一系列的10倍稀釋，各取1 mL稀釋菌液均勻接種到中性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)的每個(gè)樣品菌株的每個(gè)濃度各接種3管，在37 ℃培養(yǎng)并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)(CFU)。

1.2.3 結(jié)核分枝桿菌總RNA提取[8]分別收集不同時(shí)間點(diǎn)每個(gè)樣本結(jié)核分枝桿菌(約250 mg)置于2 mL無酶EP管中，并向管內(nèi)加入200 μL 1ⅹTE緩沖液和80 μL溶菌酶存儲(chǔ)液，將其置于37 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)過夜。次日取出無酶EP管，向每管中分別加入20 μL蛋白酶K存儲(chǔ)液，并置于42 ℃恒溫水浴鍋15 min后將細(xì)菌混合液強(qiáng)力混勻2 min。然后按照細(xì)菌RNA提取試劑盒的操作步驟抽提細(xì)菌總RNA。將獲取的總RNA洗脫液分裝到3只小型無酶PCR管中，分別用于逆轉(zhuǎn)錄成cDNA、檢測RNA的完整性和RNA的純度。

1.2.4 總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA反應(yīng) 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上的操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA存儲(chǔ)在-80 ℃冰箱備用。

1.2.5 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因PhoP和PhoR的表達(dá) 根據(jù)NCBI網(wǎng)站上提供的結(jié)核分枝桿菌的PhoP基因和PhoR基因的序列，應(yīng)用Primer 5和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)PhoP、PhoR基因以及內(nèi)參基因SigA寡核苷酸引物，引物序列見表1。并建立了適宜的的反應(yīng)體系和條件。然后采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀配套的SDS2.1軟件完成數(shù)據(jù)采集。根據(jù)ΔΔCt和2-ΔΔCt法求出各個(gè)菌株樣本中PhoP基因和PhoR基因的相對表達(dá)量。

表1 PhoR基因、PhoP基因及內(nèi)參基因SigA的引物序列

Note:F-Forward primer; R-Revevse priner.

2 結(jié) 果

2.1 MTB總RNA的提取 應(yīng)用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測量，吸光度比值(A260/A280在1.7～2.0之間，且A260>1， A260/A230>2.0)；同時(shí)應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取的總RNA進(jìn)行完整性鑒定，23S RNA和16S RNA條帶均清晰可見，并且23S條帶亮度約是16S條帶亮度的兩倍，說明總RNA完整。

2.2 PhoP基因的表達(dá)量 在低氧持留狀態(tài)下，H37Rv菌株和H37Ra菌株中在不同時(shí)間點(diǎn)的PhoP基因的ΔΔCt檢測結(jié)果見表2，H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoP基因相對表達(dá)水平見圖1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與第10 d相比，培養(yǎng)至15 d時(shí)H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoP基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了4.24倍和3.20倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且在培養(yǎng)至第25 d時(shí)，H37Rv菌株中的PhoP基因的表達(dá)水平比H37Ra菌株表達(dá)上調(diào)2.34倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 PhoR基因的表達(dá)量 在低氧持留狀態(tài)下，H37Rv菌株和H37Ra菌株中在不同時(shí)間點(diǎn)的PhoR基因的ΔΔCt檢測結(jié)果見表3，H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoR基因相對表達(dá)水平見圖2。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與第10 d相比，培養(yǎng)至第15 d時(shí)H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoR基因的表達(dá)水平分別上調(diào)了3.45倍和2.71倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且在培養(yǎng)第20 d和第25 d時(shí)，H37Rv菌株中的PhoR基因的表達(dá)水平比H37Ra菌株表達(dá)上調(diào)1.28倍和2.34倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 低氧環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌的PhoP基因在不同時(shí)間點(diǎn)的ΔΔCt檢測結(jié)果(n=5)

Tab.2 ΔΔCt test results of PhoP gene of MTB strains under low-oxygen conditions at various times (n=5)

Time(Day)M.tbstrainH37RvH37Rax±sx±s52.82±0.242.70±0.19101.37±0.131.43±0.2415-1.38±0.13a-1.00±0.18b20-2.19±0.11-1.84±0.1225-3.71±0.17c-2.48±0.13F68.58848.409P0.0000.000

Note:aP<0.05, compared with the H37Rv at 10 days;bP<0.05, compared with the H37Ra at 10 days;cP<0.05, compared with the H37Ra at 25 days.

P<0.05, compared with the H37Ra at same time.

圖1 低氧環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌菌株在不同時(shí)間點(diǎn)的PhoP基因的相對表達(dá)水平

Fig.1 Relative expression levels of PhoP of MTB strains detected under low-oxygen conditions at various times

表3 低氧環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌的PhoR基因在不同時(shí)間點(diǎn)的ΔΔCt檢測結(jié)果(n=5)

Tab.3 ΔΔCt test results of PhoR gene of MTB strains under low-oxygen conditions at various times (n=5)

Time(Day)M.tbstrainH37RvH37Rax±sx±s53.36±0.693.64±0.21102.40±0.332.45±0.2115-1.48±0.37a-1.09±0.20b20-2.62±0.35-1.96±0.2625-3.76±0.35c-2.47±0.41F54.94150.140P0.0000.000

Note:aP<0.05, compared with the H37Rv at 10 days;bP<0.05, compared with the H37Ra at 10 days;cP<0.05, compared with the H37Ra at 25 days.

P<0.05, compared with the H37Ra at same time.

圖2 低氧環(huán)境下結(jié)核分枝桿菌菌株在不同時(shí)間點(diǎn)的PhoR基因的相對表達(dá)水平

Fig.2 Relative expression levels of PhoR of MTB strains detected under low-oxygen conditions at various times

2.4 結(jié)核分枝桿菌菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 將低氧環(huán)境下分別培養(yǎng)了5 d、10 d、15 d、20 d、25 d的各樣本菌株進(jìn)行一系列的10倍稀釋，各取1 mL稀釋菌液均勻接種到中性羅氏培養(yǎng)管內(nèi)，不同時(shí)間點(diǎn)的各樣品菌株的每個(gè)濃度接種3管，并在37 ℃培養(yǎng)28 d進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)(CFU)。結(jié)果見圖3。

Note:P<0.05, compared with the H37Ra at same time.

圖3 不同毒力菌株在不同時(shí)間點(diǎn)的菌落計(jì)數(shù)

Fig.3 Colony counts for MTB strains in different virulence determined in different time points.

3 討 論

結(jié)核分枝桿菌能夠在機(jī)體內(nèi)長期處于潛伏狀態(tài)，這可能與細(xì)菌的持留性有著密切關(guān)聯(lián)。當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染宿主后，其可以被宿主的免疫細(xì)胞吞噬包裹并形成結(jié)核肉芽腫。結(jié)核肉芽腫中的結(jié)核分枝桿菌將處于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的環(huán)境中，為了適應(yīng)這些不利環(huán)境的影響結(jié)核分枝桿菌將會(huì)調(diào)控自身相關(guān)基因表達(dá)來應(yīng)對。但對于結(jié)核分枝桿菌在惡劣環(huán)境中是如何調(diào)控這些基因表達(dá)的仍然未被闡明。目前發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌具有11個(gè)雙組分調(diào)控系統(tǒng)，其中PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對結(jié)核分枝桿菌處于低氧等惡劣生存環(huán)境中具有重要的調(diào)控作用。因此本研究通過對低氧環(huán)境下處于持留狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌中的PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平的研究，來揭示結(jié)核分枝桿菌在不同低氧持留狀態(tài)下結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是否對細(xì)菌的持留性具有調(diào)控作用。

有研究表明，結(jié)核分枝桿菌處于低氧環(huán)境下可被誘導(dǎo)進(jìn)入持留狀態(tài)[9]。而且本研究發(fā)現(xiàn)，H37Rv菌株和H37Ra菌株中的PhoP基因和PhoR基因的表達(dá)水平在不同低氧持留狀態(tài)下的表達(dá)存在差異，并且隨著氧的消耗和代謝廢物的累積細(xì)菌的PhoR基因和PhoP基因的表達(dá)水平顯著上調(diào)。同時(shí)對低氧環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)的菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)管中氧的消耗，活菌數(shù)量隨之減少，菌落形態(tài)發(fā)生了改變，細(xì)菌生長速率減慢甚至停滯。這些結(jié)果提示結(jié)核分枝桿菌對低氧等不利環(huán)境的感知并調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)可能受到了結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控，并且細(xì)菌處于低氧持留狀態(tài)時(shí)可能通過下調(diào)新陳代謝和生物合成的相關(guān)通路基因的表達(dá)來應(yīng)對外界不利環(huán)境[10]，進(jìn)而使其處于無反應(yīng)的持留狀態(tài)。

為了闡明結(jié)核分枝桿菌毒力差異對細(xì)菌持留性的影響是否受到PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)對H37Rv菌株和H37Ra菌株在低氧持留狀態(tài)中的PhoR基因和PhoP基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第20 d和第25 d時(shí)H37Rv菌株的PhoR基因表達(dá)水平較H37Ra菌株分別表達(dá)上調(diào)，并且培養(yǎng)至第25 d時(shí)H37Rv菌株的PhoP基因表達(dá)水平較H37Ra菌株表達(dá)上調(diào)。而且對低氧環(huán)境下不同時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)的菌落觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第20 d和第25 d時(shí)的H37Rv菌株的活菌數(shù)比相同時(shí)間點(diǎn)的H37Ra菌株的活菌數(shù)多。這些結(jié)果均提示在低氧持留狀態(tài)中毒力強(qiáng)的菌株適應(yīng)環(huán)境變化的能力要比毒力弱的菌株強(qiáng)，并且毒力強(qiáng)弱菌株的持留性可能受到PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控。而且也有研究發(fā)現(xiàn)H37Rv菌株在低氧持留狀態(tài)下能夠調(diào)節(jié)多個(gè)持留相關(guān)基因的表達(dá)來應(yīng)對不利環(huán)境的影響[11]。

結(jié)核分枝桿菌的持留性對細(xì)菌逃避機(jī)體的免疫殺傷具有重要作用，而細(xì)菌對巨噬細(xì)胞微環(huán)境感應(yīng)并作出應(yīng)答反應(yīng)調(diào)控的作用可能更有利于細(xì)菌的持留性產(chǎn)生和對宿主的免疫逃避[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低氧持留狀態(tài)中H37Ra菌株和H37Rv菌株的PhoP基因的表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)。這個(gè)結(jié)果提示PhoP作為結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中一個(gè)重要的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，它能夠與PhoR相互協(xié)作來調(diào)控細(xì)菌相關(guān)持留基因的表達(dá)來應(yīng)對外界微環(huán)境變化。并且有學(xué)者認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)能夠與DosRST雙組分系統(tǒng)協(xié)同發(fā)揮作用，研究發(fā)現(xiàn)PhoP基因缺失突變菌株對低氧環(huán)境反應(yīng)遲鈍，而且該突變菌株中的DosR基因的表達(dá)水平下調(diào)，這個(gè)結(jié)果提示細(xì)菌處于低氧持留狀態(tài)時(shí)PhoP蛋白對DosR基因的表達(dá)可能存在調(diào)控作用[13]。而且DosRST雙組分系統(tǒng)對細(xì)菌在初期低氧環(huán)境下的生存具有重要的作用，研究結(jié)果提示DosR基因缺失菌株在低氧環(huán)境下的生存能力顯著低于野生型親本菌株，而將野生型親本菌株中的DosR基因重組到DosR基因缺失菌株中后，可以部分恢復(fù)該缺失菌株在低氧環(huán)境下的生存能力[14]。這些結(jié)果均提示在低氧持留狀態(tài)下結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)與DosRST雙組分系統(tǒng)對細(xì)菌的持留性可能具有協(xié)同的調(diào)節(jié)作用。

此外本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在低氧初期時(shí)PhoR基因和PhoP基因的表達(dá)水平在第5 d和第10 d并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與細(xì)菌在低氧初期應(yīng)答主要受到DosRST雙組分系統(tǒng)調(diào)控有關(guān)[15 -16]。但隨著氧的消耗和代謝廢物的累積MTB為了耐受低氧環(huán)境的挑戰(zhàn)，將啟動(dòng)PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)來調(diào)控耐受低氧應(yīng)答的相關(guān)基因表達(dá)。因此本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PhoR基因和PhoP基因表達(dá)水平隨著氧的消耗而表達(dá)增高。這表明結(jié)核分枝桿菌為了適應(yīng)不利環(huán)境的影響調(diào)控了相關(guān)適應(yīng)環(huán)境變化的靶基因的表達(dá)。而為了適度地調(diào)控這些基因表達(dá)，細(xì)菌中調(diào)節(jié)這些基因表達(dá)的調(diào)控基因也隨之上調(diào)其表達(dá)水平。這也進(jìn)一步提示結(jié)核分枝桿菌對外界環(huán)境變化的獨(dú)特適應(yīng)能力并不僅僅通過單一機(jī)制實(shí)現(xiàn)的，而是通過一系列復(fù)雜的調(diào)控應(yīng)答機(jī)制來完成的。

結(jié)核分枝桿菌的持留性與細(xì)菌處于惡劣的生存環(huán)境時(shí)改變自身新陳代謝途徑有關(guān)，而這些代謝途徑的改變需要細(xì)菌的調(diào)控系統(tǒng)對其進(jìn)行調(diào)節(jié)。因此本研究通過構(gòu)建低氧環(huán)境來誘導(dǎo)結(jié)核桿菌進(jìn)入持留狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌PhoPR雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)對細(xì)菌持留性可能具有調(diào)控作用。這為進(jìn)一步闡明潛伏感染時(shí)細(xì)菌持留性的調(diào)控作用提供了理論依據(jù)，也為研發(fā)新型抗?jié)摲腥镜慕Y(jié)核分枝桿菌藥物提供了藥物新靶點(diǎn)。

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Regulatory mechanisms of PhoPR two-component signal transduction system inMycobacteriumtuberculosispersistence

WU Bo1，LEI Ying2，WU Fang1，ZHANG Le1，WU Jiang-dong1,CAO Xu-dong1,ZHU Bin1,HE Li1,LI Rui-shan1,ZHANG Yu-qing1,WANG Zhao1,WANG Jun1,LIU Xiao-ling1,ZHANG Pei-pei1,LIANG Su1,ZHANG Wan-jiang1

(1.DepartmentofPathogenicBiologyandImmunologyMedicalSchoolofShiheziUniversity/TheKeyLaboratoryofEndemicandEthnicDiseaseas,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China;2.Department1ofGeriatrics,ShiheziPeople’sHospital,Shihezi832000,China)

In this study, we explored the regulatory mechanisms of PhoPR two-component signal transduction system inMycobacteriumtuberculosispersistence by analyzing the expression levels difference of PhoP gene and PhoR gene at various time in different oxygen conditions ofMycobacteriumtuberculosiswhich were induced persistent state under low-oxygen conditions. The international standard avirulent strains ofMycobacteriumtuberculosis(H37Ra) and the international standard virulent strains ofMycobacteriumtuberculosis(H37Rv) were cultured under different low-oxygen conditions, then the total RNA extracted from each sample strain and the integrity of the RNA were checked by gel electrophoresis. The expression of PhoP gene and PhoR gene were quantified by using SYBR Green I FQ-PCR. The expression levels difference of these genes were compared in different low-oxygen conditions ofMycobacteriumtuberculosis. The expression levels of PhoP gene and PhoR gene ofMycobacteriumtuberculosisunder low-oxygen conditions were measured at various times. The expression level of PhoP gene and PhoR gene of H37Rv strain and H37Ra strain cultured for 15 days compared with 10 days were significantly up-regulated (P<0.05); and the expression level of PhoP gene and PhoR gene of H37Rv strain cultured for 25 days were up-regulated by 2.34 times compared with H37Ra strain (P<0.05). In this study, there are differences under different low-oxygen conditions in the expression levels of PhoP gene and PhoR gene ofMycobacteriumtuberculosisPhoPR two-component signal transduction system at various time and same virulent strains, and there are differences under the same low-oxygen condition in the expression levels of PhoP gene and PhoR gene ofMycobacteriumtuberculosisPhoPR two-component signal transduction system at the same time and different virulent strains. Therefore, the system plays a regulatory role inMycobacteriumtuberculosispersistence.

Mycobacteriumtuberculosis; persistence; PhoPR two-component signal transduction system

Zhang Wan-jiang, Email:zwj1117@sina.com

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81260261, 81160192)

張萬江, Email: zwj1117@sina.com

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室/石河子大學(xué)《新疆地方與民族高發(fā)病》教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子 832000； 2.石河子市人民醫(yī)院老年病一科，石河子 832000

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.02.005

R378

A

1002-2694(2015)02-0116-05

2014-06-17；

2014-11-26

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.81260261 and 81160192)