乳腺癌組織CCR7的表達(dá)及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系*

徐 蘊(yùn) 張肇林 竇珊珊 崔利德

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067；2蓬萊市人民醫(yī)院，山東 蓬萊 265600)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

乳腺癌組織CCR7的表達(dá)及其與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系*

徐 蘊(yùn)1張肇林2竇珊珊1崔利德1

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院， 山東 濟(jì)寧 272067；2蓬萊市人民醫(yī)院，山東 蓬萊 265600)

目的 研究趨化因子受體-7(chemokine receptor 7,CCR7)在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義，并探討CCR7與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)檢測CCR7、EMT相關(guān)標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄因子Slug和N-cadherin的表達(dá)，分析CCR7與患者病理特征的關(guān)系。結(jié)果 1)CCR7在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=5.061，P<0.05)；2)CCR7在人乳腺癌組織的表達(dá)隨患者病理分期的增加(Ⅰ→Ⅳ)而增加；3)CCR7、Slug和N-cadherin在人乳腺癌組織中均呈高表達(dá)，陽性率分別為60.71 % (34/56)、66.07 % (37/56)、76.78 % (43/56)；4)CCR7與Slug、N-cadherin在乳腺癌組織的表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 CCR7在人乳腺癌組織中的表達(dá)與EMT的指標(biāo)密切相關(guān)，可能是判斷癌轉(zhuǎn)移的特異性指標(biāo)。

CCR7；乳腺癌；Slug；N-cadherin；淋巴轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，而乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是患者死亡最主要的原因[1]。乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等病理過程涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。目前，EMT發(fā)生的分子機(jī)制還不完全清楚。最近有研究報道，CC族趨化因子受體-7(chemokine receptor 7，CCR7)的配體CCL21可調(diào)節(jié)EMT細(xì)胞向淋巴內(nèi)皮細(xì)胞趨化遷移[3]。然而，CCR7與某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)系及機(jī)制尚不清楚。本文采用免疫組織化學(xué)檢測CCR7的表達(dá)，分析其表達(dá)與EMT的關(guān)系，探討CCR7的臨床意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

收集蓬萊市人民醫(yī)院乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本56例。其中>50歲者29例，≤50歲者27例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者40例，非轉(zhuǎn)移者16例；臨床病理分期Ⅰ～Ⅱ者31例，Ⅲ～Ⅳ者25例。患者術(shù)前均未接受任何放療及化療，術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為乳腺癌。標(biāo)本組織經(jīng)4% 甲醛浸泡固定并經(jīng)石蠟包埋，連續(xù)5μm 切片。

1.2 主要試劑

小鼠抗人CCR7 單抗購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗人 Slug 單抗及N-cadherin 單抗；山羊抗小鼠二抗試劑盒、DAB 顯色液均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色 組織切片常規(guī)脫蠟、水化；組織抗原采用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖劑熱修復(fù)(100 ℃、15 min)，自然冷卻至室溫；PBS洗滌后，用3%的過氧化氫浸泡10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗5 min/次，共3次，加入山羊血清封閉20 min，然后滴加小鼠抗人CCR7(1∶300)/Slug/N-cadherin(1∶200)一抗，放入4 ℃冰箱過夜；PBS沖洗5 min/次，共3次，滴加山羊抗小鼠二抗孵育20min，PBS浸洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。以PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 免疫組化陽性評價 以細(xì)胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，以陽性細(xì)胞百分率和著色強(qiáng)度的評分作為標(biāo)準(zhǔn)，采用半定量積分法判斷染色結(jié)果。著色強(qiáng)度與背景色相比記分如下：無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性癌細(xì)胞百分率記分：在低倍鏡下隨機(jī)選取5個視野，高倍鏡下計數(shù)，每個視野記錄100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分率，取平均數(shù)，其中無陽性細(xì)胞即0%為0分；0%～25 % 為1分；25%～50 % 為2分；>50 % 為3分。以著色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分率評分的乘積作為最終分值，范圍從0至9；<4分記為陰性或低表達(dá)，≥4分記為陽性或高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織中CCR7與EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)

56例人乳腺癌組織中CCR7、Slug及N-cadherin蛋白均呈高表達(dá)，表達(dá)率分別為60.71 % (34/56)、66.07 % (37/56)、76.78 % (43/56)。CCR7與N-cadherin主要表達(dá)于癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和細(xì)胞膜，Slug蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核(圖1)。此外，在細(xì)胞基質(zhì)及癌旁組織中也檢測到CCR7、Slug及N-cadherin。

2.2 CCR7表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系

CCR7、Slug及N-cadherin 的表達(dá)與患者的年齡無關(guān)(P>0.05)；CCR7、Slug及N-cadherin在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性表達(dá)率為70.00% (28/40)、75.00 % (30/40)、85.00 % (34/40)，而無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率為37.50 % (6/16)、43.75 % (7/16)、56.25 % (9/16)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者CCR7、Slug及N-cadherin的表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CCR7、Slug及N-cadherin在臨床病理分期Ⅰ～Ⅱ中的陽性表達(dá)率為51.61 % (16/31)、54.84 % (17/31)、64.52 % (20/31)，而在Ⅲ～Ⅳ分期中的陽性表達(dá)率為80.00 % (20/25)、84.00 % (21/25)、92.00% (23/25)，臨床病理分期Ⅲ～Ⅳ期的患者CCR7、Slug及N-cadherin的表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

A:CCR7；B:N-cadherin；C:Slug

圖1 CCR7/N-cadherin/Slug在乳腺癌組織中陽性表達(dá)(免疫組化染色 ×400)

表1 CCR7、EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

2.3 CCR7與Slug、N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

對56例人乳腺癌組織中CCR7、Slug及N-cadherin的表達(dá)結(jié)果分析顯示： CCR7的表達(dá)與Slug(r=0.393，P=0.001)、N-cadherin(r=0.39，P=0.002) 均呈正相關(guān)，見表2。

表2 人乳腺癌組織中 CCR7與 N-Cadherin/Slug之間的表達(dá)關(guān)系

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌最重要的生物學(xué)特性之一，也是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)或其他器官侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制依然未完全被闡明。

CCR7屬于G蛋白偶聯(lián)的跨膜蛋白，主要表達(dá)于T淋巴細(xì)胞和成熟樹突細(xì)胞表面，其配體是CCL21或CCL19[4-5]。CCR7及其配體在介導(dǎo)機(jī)體內(nèi)淋巴細(xì)胞的遷移過程中具有重要作用[6]。近來研究顯示：CCR7廣泛表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，如乳腺癌、食管癌以及頭頸癌[7]；CCL21/CCR7在腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮十分重要的作用。

EMT是指上皮細(xì)胞失去其細(xì)胞極性、細(xì)胞間黏附力下降、具有較強(qiáng)的運(yùn)動性等間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程，在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、多種纖維化疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[8]，其主要特征包括黏附分子如E-鈣黏蛋白 (E-cadherin) 的表達(dá)降低同時獲得轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug以及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)[9]。EMT標(biāo)記物廣泛表達(dá)于多種腫瘤并且與腫瘤的侵襲擴(kuò)散有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)許多因子能激活腫瘤細(xì)胞相應(yīng)受體信號程序發(fā)生EMT，使其獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力，如胰島素樣生長因子(IGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)。本文采用免疫組化檢測了CCR7及EMT標(biāo)記物Slug、N-cadherin在人乳腺癌組織中的表達(dá)。結(jié)果顯示，癌細(xì)胞CCR7、Slug及N-cadherin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床病理分期密切相關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及乳腺癌Ⅲ～Ⅳ期患者的CCR7、Slug及N-cadherin的表達(dá)明顯升高，說明CCR7可能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移過程。而后我們進(jìn)一步分析了CCR7與EMT標(biāo)記物(Slug、N-cadherin)之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)CCR7的表達(dá)與Slug、N-cadherin的表達(dá)均呈正相關(guān)，提示CCR7與乳腺癌EMT的發(fā)生關(guān)系密切，其機(jī)制有待進(jìn)一步實驗研究證實。信號通路研究表明，CCR7可通過激活MAPK、AKT信號途徑參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[10]。而在EMT的發(fā)生中，MAPK、AKT可以激活Smad、Slug及Twist[11]等轉(zhuǎn)錄因子，共同調(diào)節(jié)EMT標(biāo)志物的表達(dá)。因此，我們認(rèn)為CCR7可能通過激活MAPK或AKT途徑而激活Snail、Slug及Twist等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞表達(dá)N-cadherin等EMT標(biāo)志物，發(fā)生轉(zhuǎn)移；可能是判斷癌轉(zhuǎn)移的特異性指標(biāo)。

[1] Grabau D,Dihge L,Ferno M,et al.Completion axillary dissection can safely be omitted in screen detected breast cancer patients with micrometastases.A decade’s experience from a single institution[J].Eur J Surg Oncol，2013，39(6):601-607.

[2] Mukaida N,Baba T.Chemokines in tumor development and progression[J].Exp Cell Res，2012，318(2):95-102.

[3] Pang M F,Georgoudaki A M,Lambut L,et al.TGF-β induced EMT promotes targeted migration of breast cancer cells through the lymphatic system by theactivation of CCR7/CCL21-mediated chemotaxis[J].Oncogene， 2015，doi:10.1038/onc.

[4] 熊化保，司傳平，張惠.固有淋巴細(xì)胞研究進(jìn)展[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，38(2)：77-81.

[5] 石俊強(qiáng).淋巴管生成與疾病[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，38(5)：349-355.

[6] Sanchez-Sanchez N,Riol-Blanco L,de la Rosa G,et al.Chemokine receptor CCR7 induces intracellular signaling that inhibits apoptosis of mature dendritic cells[J].Blood，2004，104:619-625.

[7] Oliveira-Neto H H,de Souza P P,da Silva M R,et al.The expression of chemokines CCL19,CCL21 and their receptor CCR7 in oral squamous cell carcinoma and its relevance to cervical lymph node metastasis[J].Tumour Biol，2013，34:65-70.

[8] Thiery J P,Acloque H,Huang R Y,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease[J].Cell，2009，139(5):871-890.

[9] De Craene B,Berx G.Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression[J].Nat Rev Cancer，2013，13(2):97-100.

[10] Kuwabara T,Tanaka Y,Ishikawa F,et al.CCR7 ligands upregulate IL-23 through PI3 kinase and NF-κB pathway in dendritic cells[J].J Leukoc Biol，2012，92:309-318.

[11] Hough C,Radu M,Dore J J.TGF-Beta induced ERK phosphorylation of smad linker region regulates Smad signaling[J].PLoS One，2012，7:e42513.

Expression of CCR7 and its correlation with epithelial-mesenchymal transition in breast carcinoma

XUYun,ZHANGZhaolin,DOUShanshan,CUILide

(School of Basic Sciences,Jining Medical University,Jining 272067,China)

ObjectiveTo investigate the association between the expression of CCR7 and clinical parameters in human breast carcinoma and analyze the relationship between CCR7 and the epithelial-mesenchymal transition (EMT).MethodsCCR7,Slug and N-cadherin were examined by immunohistochemistry in 56 cases of breast carcinoma tissues.The correlation between clinical parameters and CCR7 expression were retrospectively analyzed.Results1)The expressions of CCR7 in lymph node metastasis group were significantly higher than those in the group that without lymph node metastasis (χ2=5.061，P<0.05).2)The expression of CCR7 in human breast cancer increased with the increase of the pathological stage of the patients.3)High expressions of CCR7,Slug and N-cadherin were found in human breast carcinoma and the positive rate was 60.71%,66.07% and 76.78 % respectively.4)The CCR7 expression was significantly associated to Slug and N-cadherin(P<0.001).ConclusionCCR7 was closely related to EMT indicators (Slug and N-cadherin) in human breast carcinoma.CCR7 may play a role in the genesis of EMT in human breast carcinoma and be expected to become the biomarker of cancer metastasis.

CCR7;Breast carcinoma;Slug;N-cadherin;Lymph node metastasis

* [基金項目]2013年濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院科研計劃項目(編號：JY2013KJ014)

10.3969/j.issn.1000-9760.2015.06.003

R737.9

A

1000-9760(2015)12-394-04

2015-09-08)