35株多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因分布研究*

羅卉麗，陳姍姍，楊宏偉，趙 穎，昌睿杰△

(1.湖北省十堰市婦女兒童醫(yī)院 442000；2.湖北省十堰市太和醫(yī)院 442000)

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·論 著·

35株多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌的β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因分布研究*

羅卉麗1，陳姍姍1，楊宏偉2，趙 穎2，昌睿杰2△

(1.湖北省十堰市婦女兒童醫(yī)院 442000；2.湖北省十堰市太和醫(yī)院 442000)

目的 對十堰地區(qū)2014年分離的35株多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)進行耐藥表型、耐藥基因研究。方法 收集十堰地區(qū)2014年分離的35株多重耐藥SMA，采用紙片擴散法檢測細菌耐藥性。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)采用標準紙片法檢測，頭孢菌素酶(AmpC)和金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)檢測采用三維試驗，非金屬碳青霉烯酶(KPC)檢測采用改良Hodge試驗。采用PCR法檢測細菌耐藥基因,對陽性結(jié)果進行基因正、反向測序分析。結(jié)果 35株多重耐藥SMA中，ESBLs、AmpC、MBLs、KPC陽性率分別為45.7%、14.3%、94.3%、0.0%。耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、blaOXA-10、oprD2的陽性率分別為22.8%(8/35)、11.4%(4/35)、17.1%(6/35)、94.3%(33/35)、8.6%(3/35)、28.5%(10/35)。結(jié)論 該地區(qū)的多重耐藥SMA對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥狀況非常嚴重，應(yīng)引起重視。

醫(yī)院感染； 多重耐藥嗜麥芽窄食單胞菌； β-內(nèi)酰胺酶； 耐藥基因

嗜麥芽窄食單胞菌(SMA)是廣泛分布于自然界的條件致病菌，也是醫(yī)院感染最常見的病原菌之一。近10年來，SMA在醫(yī)院感染導(dǎo)致死亡的流行病菌中所占的比例越來越高[1]。廣州呼吸疾病研究所2003～2007年從下呼吸道分離的1 709株革蘭陰性菌中，SMA占9.2%，占調(diào)查分離菌的第3位[2]；吳明芝等[3]報道在兒科臨床標本中，SMA陽性率為4.6%，在革蘭陰性桿菌中位居第4。中國CHINET細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)表明，SMA有較高的耐藥率[4]。本研究旨在調(diào)查2014年十堰地區(qū)分離的35株多重耐藥SMA的耐藥基因分布情況，為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，減少SMA耐藥菌株的暴發(fā)流行及傳播奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年分離自十堰市太和醫(yī)院和十堰市婦幼保健院患者血液標本的多重耐藥SMA，共35株，對于同一患者血液分離的重復(fù)菌株則選取第1次分離的菌株。

1.2 儀器與試劑 DLMedcal-96Ⅱ全自動細菌鑒定系統(tǒng)(迪爾醫(yī)學(xué))；PE9600型DNA擴增儀(美國PE公司)；電腦三恒多用電泳儀DYY-12電泳儀(北京六一儀器廠)；BacT/ALERT?3D血培養(yǎng)儀(法國梅里埃公司)；G-BOX全自動凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)；3730型全自動基因測序儀(美國ABI公司)。DL-96E細菌測定系統(tǒng)隨機體外診斷試劑板(珠海迪爾醫(yī)學(xué)公司)；細菌微量生化反應(yīng)管(杭州天和微生物試劑公司)；PCR Master Mix試劑(美國Promega公司)；抗菌藥物紙片(英國Oxoid公司)。基因blaTEM-1、blaSHV、blaCARB-2、blaIMP、blaOXA-10、oprD2、blaKPC、blaPER、blaVEB、blaGES、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-1、blaOXA-2所用引物設(shè)計參考文獻[5-7]，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細菌鑒定和藥敏試驗 血培養(yǎng)采用BacT/ALERT 3D血培養(yǎng)儀，細菌鑒定采用DLMedcal-96Ⅱ全自動細菌鑒定系統(tǒng)完成，藥敏試驗采用紙片擴散法進行。

1.3.2 耐藥表型檢測 分別進行β-內(nèi)酰胺酶的提取及檢測，包括：超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)檢測(標準紙片法)、頭孢菌素酶(AmpC)檢測(三維試驗)、金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBLs)檢測(三維試驗)、非金屬碳青霉烯酶(KPC)檢測(改良Hodge試驗)。

1.3.3 耐藥基因檢測 各種靶基因PCR擴增體系均使用Promega的PCR Master Mix試劑，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，2 min，1個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，1個循環(huán)。將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像分析儀拍攝凝膠照片。以大腸埃希菌ATCC25922或空白為陰性對照(陽性對照DNA由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供)。

1.3.4 基因序列分析 電泳陽性的PCR產(chǎn)物純化后用全自動熒光法正、反向測序，采用讀序工具Chromas軟件察看測序彩圖，測序結(jié)果登錄互聯(lián)網(wǎng)(www.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST比對。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 藥敏結(jié)果采用WHONET 5.5軟件統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 35株多重耐藥SMA的藥敏試驗結(jié)果，見表1。

表1 多重耐藥SMA的藥敏試驗結(jié)果(%)

2.2 耐藥表型 35株多重耐藥SMA β-內(nèi)酰胺酶試驗均為陽性，其中ESBLs陽性為16株(45.7%)，AmpC陽性為5株(14.3%)，MBLs陽性33株(94.3%)，KPC均為陰性，見圖1～3。

圖1 ESBLs陽性結(jié)果

2.3 β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因檢測結(jié)果 35株多重耐藥SMA中，耐藥基因blaTEM、blaSHV、blaCARB、blaIMP、blaOXA-10、oprD2的陽性率分別為22.8%(8/35)、11.4%(4/35)、17.1%(6/35)、94.3%(33/35)、8.6%(3/35)、28.5%(10/35)。未檢出blaKPC、blaPER、blaVEB、blaGES、blaVIM、blaSPM、blaGIM、blaDHA、blaOXA-1、blaOXA-2陽性菌株。β-內(nèi)酰胺酶相關(guān)基因檢測電泳圖，見圖4～9(其中，N為陰性對照，P為陽性對照，S為標本，M為DNA標志物，從下向上依次為150、250、350、450、550、650、750、850、1 000、1 500 bp) 。

圖2 AmpC陽性結(jié)果

圖3 MBLs陽性結(jié)果

圖4 blaTEM基因電泳圖

2.4 基因序列分析結(jié)果 擴增陽性基因所測序列采用GenBank中的BLAST程序進行同源性分析。blaTEM基因與GenBank注冊號為AB282997的TEM-1亞型基因序列相同；blaCARB基因與GenBank注冊號為HQ157204的CARB-2亞型基因序列相同；blaOXA-10與GenBank注冊號為GU367339的OXA-10亞型基因序列相同；oprD2基因與GenBank注冊號為GQ324957的基因序列相同。blaSHV、blaIMP基因與GenBank注冊的基因同源性均低于90%，是否是新的基因亞型有待于進一步研究。

圖4 blaSHV基因電泳圖

圖6 blaCARB基因電泳圖

圖7 blaIMP基因電泳圖

圖8 blaOXA-10基因電泳圖

圖9 oprD2基因電泳圖

3 討 論

β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物是臨床最常用、品種數(shù)量最多的抗菌藥物[8]，此類抗菌藥物具有血藥濃度高、殺菌活性強、毒性低、抗菌譜廣等特點，因此很受臨床青睞。然而近年來隨著β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，特別是在臨床治療過程中的預(yù)防使用及濫用，使得產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的細菌越來越多。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物在此酶的作用下β-內(nèi)酰胺環(huán)水解開環(huán)，使其失去了干擾細菌細胞壁合成的功能。目前，臨床對產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶細菌感染的治療越來越困難，已成為臨床醫(yī)務(wù)工作者關(guān)注的重點。

本次35株多重耐藥SMA中，ESBLs表型檢測陽性16株(45.7%)，其中基因檢測結(jié)果blaTEM陽性8株(22.8%)，blaSHV陽性4株(11.4%)。ESBLs是能水解氧亞胺基β-內(nèi)酰胺抗菌藥物，并可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑(如舒巴坦、三唑巴坦、克拉維酸)所抑制的一類酶[9-10]。CARB是由質(zhì)粒介導(dǎo)的羧芐西林酶，它有9個亞型。PCR檢出blaCARB陽性菌6株(17.1%)，基因序列分析顯示，該菌所產(chǎn)的CARB基因為CARB-2亞型。OXA型酶對氯唑西林、苯唑西林和青霉素有很高的水解活性。PCR檢出blaOXA-10陽性菌3株(8.6%)，未檢測出攜帶blaOXA-1、blaOXA-2基因的菌株，表明在本地區(qū)，攜帶blaOXA-10可能導(dǎo)致細菌產(chǎn)ESBLs，它們往往由位于可移動的遺傳因子的基因編碼，這可能是它們在細菌的廣泛傳播的原因之一。本次研究中的35株多重耐藥SMA，經(jīng)三維試驗檢出產(chǎn)AmpC菌5株，占14.3%。PCR未檢出攜帶blaDHA基因的細菌。AmpC能夠有效地水解青霉素類、頭霉素類和頭孢菌素類抗菌藥物等，從而導(dǎo)致細菌對第3代頭孢菌素產(chǎn)生耐藥性?？咕幬锾貏e是頭孢西丁和亞胺培南可使細菌誘導(dǎo)表達AmpC類β-內(nèi)酰胺酶。本試驗中，AmpC陽性表型檢出率較高，但未檢出攜帶blaDHA基因的細菌，說明本地區(qū)AmpC引起的SMA耐藥不是由blaDHA基因編碼的質(zhì)粒介導(dǎo)。本次MBLs三維試驗檢出陽性菌株33株，陽性率為94.3%，blaIMP基因陽性菌33株，陽性率94.3%，基因檢測陽性率與耐藥表型陽性率一致。藥敏試驗顯示，35株多重耐藥SMA對亞胺培南、美羅培南的耐藥率達100.0%，主要與攜帶MBLs耐藥基因blaIMP有關(guān)，blaIMP基因陽性率為94.3%，與亞胺培南耐藥率基本一致。本次檢出oprD2基因陽性菌10株(28.5%)，oprD2基因缺失率高達71.5%，oprD2基因缺失導(dǎo)致SMA對親水性化合物產(chǎn)生低外膜通透性，抗菌活性可以通過外膜孔蛋白通道(OprD)的缺失而失去抗菌活性[11]?？傮w而言，本地區(qū)的多重耐藥SMA對碳青酶烯類抗菌藥物的耐藥狀況非常嚴重，應(yīng)引起重視。

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Study of distribution of β-lactamase drug resistance gene in 35 strains of multi-drug resistant Stenotrophomonas maltophilia*

LUOHui-li1,CHENShan-shan1,YANGHong-wei2,ZHAOYing2,CHANGRui-jie2△

(1.ShiyanmunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Shiyan,Hubei442000,China; 2.TaiheHospitalofShiyanCity,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To study the drug-resistance phenotype and drug resistance gene in 35 strains of multi-drug resistant Stenotrophomonas maltophilia(SMA) in Shiyan area during 2014.Methods 35 strains of multi-drug resistant SMA isolated from Shiyan area during 2014 were collected and their drug resistance was detected by using the K-B method.ESBLs was detected by using the standard paper strip method.AmpC and MBLs were detected by the three-dimensional test, KPC was detected by the modified Hodge test.The PCR method was adopted to detect the bacterial drug resistance gene and the positive results were performed the forward and reverse gene sequencing analysis.Results Among 35 strains of multi-drug resistance SMA,the positive rates of ESBLs,AmpC,MBLs and KPC were 45.7%,14.3%, 94.3% and 0.0% respectively.The positive rates of drug resistance geneblaTEM,blaSHV,blaCARB,blaIMP,blaOXA-10andoprD2 were 22.8%(8/35),11.4%(4/35),17.1%(6/35),94.3%(33/35),8.6%(3/35) and 28.5%(10/35) respectively.Conclusion The resistance of multi-drug resistance SMA in this area to carbapenem antibacterial drugs is very serious, which should arouse the attention.

nosocomial infection； drug-resistant stenotrophomonas maltophilia； β-lactamase； drug resistant gene

湖北省衛(wèi)生計生科研基金資助項目(WJ2015Z115)；湖北省十堰市科技局科技計劃立項(15K71)。

羅卉麗，女，碩士，主管技師，主要從事腫瘤檢驗研究。

△通訊作者，E-mail：2671815504@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.19.010

A

1672-9455(2015)19-2839-03

2015-06-05

2015-08-10)