微小RNA在急性心肌梗死中調(diào)控作用的研究進(jìn)展*

彭蘭芬，陳載鑫，張少豐，辛培建 綜述，朱振宇△> 審校

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東東莞 523945；2.中山大學(xué)臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，廣州 510080)

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·綜 述·

微小RNA在急性心肌梗死中調(diào)控作用的研究進(jìn)展*

彭蘭芬1，陳載鑫1，張少豐1，辛培建2綜述，朱振宇2△> 審校

(1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬厚街醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)中心，廣東東莞 523945；2.中山大學(xué)臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化研究中心，廣州 510080)

微小RNA； 急性心肌梗死； 生物標(biāo)志物

急性心肌梗死(AMI)是冠心病的一種危重臨床類型，其進(jìn)展迅速，后果嚴(yán)重。如果在數(shù)小時內(nèi)得不到明確診斷及適當(dāng)?shù)闹委?，心肌就會缺血缺氧造成不可逆的壞死，因此，AMI的早期診斷至關(guān)重要。

微小RNA(miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中。它由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但并不翻譯成蛋白質(zhì)，而是在蛋白質(zhì)合成中調(diào)節(jié)其他基因功能，因此miRNA是調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因的基因[1]。miRNA在生物的生長、發(fā)育和疾病發(fā)生的病理生理機(jī)制中扮演著重要角色，許多疾病以一種或幾種miRNA表達(dá)異常為特征。確定組織或者血漿中表達(dá)量異常的miRNA種類，對于疾病的早期診斷和發(fā)展進(jìn)程都有重要作用[2]。循環(huán)外周血液中心肌細(xì)胞來源的miRNAs在心血管系統(tǒng)疾病發(fā)生的生理和病理機(jī)制中都發(fā)揮非常重要的作用，其表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于各種釋放到循環(huán)血液中的蛋白質(zhì)如各種心肌生化標(biāo)志物的出現(xiàn)，是心血管疾病新的標(biāo)志物，多種心血管系統(tǒng)疾病的病理改變早期有miRNA分子的參與，包括AMI、心肌病、心律失常和動脈血管硬化等[3]。盡管miRNA 的功能尚待闡明，但通過對其表達(dá)譜的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNA具有很強(qiáng)的細(xì)胞、組織或疾病特異性，這些特異表達(dá)的miRNA既是其功能研究的基礎(chǔ)，又是很好的疾病標(biāo)志物[4]。

1 miRNA生物合成及功能

miRNA的合成從轉(zhuǎn)錄生成初級miRNA(pri-miRNA)開始，通過Drosha和Dicer等相關(guān)合成酶的加工，最終生成成熟的miRNA，成熟的miRNA和相關(guān)蛋白質(zhì)形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC，也稱miRISC)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程[5]。

成熟miRNA調(diào)控靶mRNA翻譯的機(jī)制主要有三種：(1)二者不完全互補(bǔ)，即二者不完全配對結(jié)合時，主要影響翻譯過程，而對mRNA的穩(wěn)定性無任何影響。(2)二者完全互補(bǔ)，即二者完全配對結(jié)合后，類似siRNA與靶mRNA的結(jié)合，特異性的切割mRNA。(3)上述兩種模式均具備，當(dāng)其與靶mRNA完全互補(bǔ)配對時，直接靶向切割mRNA，而不完全互補(bǔ)配對時起調(diào)節(jié)基因翻譯的作用。

上述miRNA調(diào)控mRNA表達(dá)的機(jī)制說明miRNA與靶mRNA不是一一對應(yīng)的關(guān)系，一個miRNA可以調(diào)控不同的mRNA的表達(dá)，而多個miRNA可以調(diào)控同一個mRNA的表達(dá)。鑒于miRNA在生物體擔(dān)負(fù)著舉足輕重的作用，越來越多的實驗室開展了miRNA的相關(guān)研究?，F(xiàn)在，對miRNA生物機(jī)制的研究和miRNA與疾病關(guān)系的研究已成為世界生物學(xué)的研究熱點之一。

2 miRNA在AMI中的調(diào)控作用

2.1 miRNA與動脈粥樣硬化病理進(jìn)程相關(guān) AMI最根本的原因是冠狀動脈粥樣硬化和在此基礎(chǔ)上形成冠狀動脈血栓所致。miRNA可以通過對內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等相關(guān)細(xì)胞功能和形態(tài)的調(diào)控，通過影響脂質(zhì)代謝途徑、慢性炎性反應(yīng)過程及對血小板的活化和聚集，參與冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)病過程。最近Loyer等[6]在小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化進(jìn)程與血管內(nèi)血流切變力和氧化型低密度脂蛋白膽固醇(oxLDL)密切相關(guān)，提出miRNA-92a為動脈粥樣硬化相關(guān)miRNA，稱其為atheromiR。通過對小鼠動脈和人動脈粥樣硬化斑塊分析顯示，miRNA-92a作為動脈粥樣硬化的候選miRNA，在低切變力和oxLDL的共同作用下，可調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的活化并優(yōu)先表達(dá)于低切變力處。miRNA-92a的這種表達(dá)方式與Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子(KLF)2、KLF4和細(xì)胞信號傳導(dǎo)抑制因子5相關(guān)，所以通過抑制其表達(dá)可防止內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和動脈粥樣硬化的發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn),miRNA-126參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖及凋亡，敲除老鼠 miRNA-126的基因序列后，造成血管完整性的破壞及影響血管的形成；miRNA-21通過增加黏附分子作用于過氧化物酶增殖物激活受體α(PPAR-α),使PPAR-a表達(dá)減少，促進(jìn)動脈粥樣硬化進(jìn)展；miRNA-146a與動脈粥樣斑塊形成的病理過程及斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)[7-9]。

2.2 miRNA與心臟基因調(diào)控有關(guān) miRNA的表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性，目前認(rèn)為具肌肉和心臟組織特異性且在心肌細(xì)胞中表達(dá)豐富miRNA有五種，分別為miR-1、miR-133、miR-206、miR-208、miR-499。其中miR-1和miR-133具肌肉特異性并調(diào)節(jié)心臟的生長發(fā)育；miR-208和miR-499則具有心臟組織特異性并且在心肌中表達(dá)豐富。以上miRNA在AMI等心臟疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷、預(yù)后和治療方面均具有重大意義[10]?，F(xiàn)已有研究提示miR-1、miR-18b、miR-21、miR-133、miR-195、miR-208等參與控制或調(diào)節(jié)心肌肥大這一病理過程。miR-1、miR-133a、miR-208在AMI鼠動物模型或冠脈閉塞-局部缺血再灌注豬動物模型中均顯著升高，并在120 min內(nèi)呈現(xiàn)高峰。而在經(jīng)皮冠脈介入治療的STEMI患者循環(huán)血漿中均顯著升高，其中miR-208最初檢測不到，在癥狀出現(xiàn)后約1 h隨即升高，在12 h內(nèi)呈現(xiàn)峰值。同時認(rèn)為miR-1和miR-133與腎小球過濾率有負(fù)相關(guān)，表明其可能在一定時間段后被腎清除，并在尿液中檢測到，但未檢測到miR-208。miR-208與肌鈣蛋白T和射血分?jǐn)?shù)相關(guān)[11-12]。

2009年美國新澤西州學(xué)者Dong等[13]在AMI大鼠模型中研究了miR-21的表達(dá)情況，認(rèn)為miR-21在梗死區(qū)明顯下調(diào)，而在梗死區(qū)周邊卻上調(diào)；梗死區(qū)的過表達(dá)可明顯減少梗死面積；2011德國學(xué)者關(guān)于AMI患者外周血液中的全基因組miR表達(dá)分析的相關(guān)研究表明，miR-1291、miR-663b具有診斷AMI的高敏感度和特異度，采用20個miRNA譜，其診斷效能更佳(敏感度90%、特異度96%、準(zhǔn)確度93%)，而miR-30c、miR-145表達(dá)水平與梗死范圍大小及心肌鈣蛋白T(cTnT)釋放相關(guān)，認(rèn)為miR是潛在治療靶標(biāo)[14]。

國內(nèi)學(xué)者對心肌梗死相關(guān)性miRNA研究情況：2010年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)研究人員對循環(huán)血液中的miR-1進(jìn)行了研究，認(rèn)為其可作為潛在的AMI標(biāo)志物[15]；山東徐冬梅等[16]研究認(rèn)為 miR-1與心肌缺血損傷有關(guān)；韋永強(qiáng)等[17]為觀察AMI患者miR-1表達(dá)情況和體外反搏治療(ECP)對其水平的影響，結(jié)果顯示miR-1可作為AMI患者發(fā)病和病情進(jìn)展的一項新型標(biāo)志物。ECP可使miR-1表達(dá)下調(diào)，患者心功能獲得改善。

2.3 參與心肌纖維化 心肌纖維化是由中度至重度的冠狀動脈粥樣硬化性狹窄引起心肌纖維持續(xù)性和(或)反復(fù)加重的心肌缺血缺氧所產(chǎn)生的結(jié)果，是心臟重塑的另一重要病理改變。miR-29家族(miR-29a、miR-29b、miR-29c)與心肌纖維化相關(guān)[18]，能夠抑制心肌纖維化的發(fā)生。在心臟中miR-29主要表達(dá)于心肌成纖維細(xì)胞，許多細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因(如ELN、FBN1、COL1A1、COL1A2、COL3A1)是miR-29的靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生心肌梗死后第3天miR-29下調(diào)與I型、III型膠原蛋白相關(guān)基因(COL1A1、COL1A2、COL3A1)表達(dá)上調(diào)有關(guān)，且在梗死邊緣區(qū)出現(xiàn)彈性蛋白表達(dá)增加[10]。miR 133 和miR 30c也與心肌纖維化有關(guān)。北京施冰等[19]研究了大鼠AMI模型miR-214的表達(dá)變化，認(rèn)為miR-214可能參與調(diào)控了心肌梗死后心室重塑。

2.4 參與血管新成的miRNA miR-130a、miR-17～92簇和miR-378是促進(jìn)血管生成的miRNA，而miR-221、miR-222則通過作用于其靶基因干細(xì)胞因子受體c-kit并間接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮酶(eNOs)的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞分化、增殖、血管生成，而miR-15b通過可能的靶基因血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素2(Ang2)來抑制新血管和生成[10]。miR-320的許多靶基因均與血管生成相關(guān)。miRNA-126在新血管形成中發(fā)揮了重要作用，血管內(nèi)皮miRNA-126是缺血相關(guān)血管生成信號的重要潛在靶點和調(diào)節(jié)位點[9，20]。

2.5 miRNA與心肌細(xì)胞電生理調(diào)控 心臟的電生理活動由離子通道和膜蛋白控制，miRNA調(diào)節(jié)心臟傳導(dǎo)和心律失常。AMI后心律失常的發(fā)生率幾乎為100%，室性心律失常是心臟猝死的高風(fēng)險因素，而心力衰竭則是心血管疾病病變的終末期。心衰患者發(fā)生房顫最為常見，是患者死亡的主要原因。目前關(guān)于探討離子通道等相關(guān)基因與miRNA的關(guān)系成為研究熱點[21]。研究較多的是miRNA-1、miRNA-328、miRNA-26和miRNA-499。miRNA-1具心肌特異性，在房顫患者組織樣品中表達(dá)減少86%，其作用靶點是心臟內(nèi)向整流鉀通道電流和間隙連接蛋白基因；有趣的是，其在室性心律失常下表達(dá)水平卻增加。因此在心房與心室不同組織中其調(diào)控作用有待進(jìn)一步深入研究；miRNA-26也可有效地抑制內(nèi)向整流鉀通道電流減少心律失常的發(fā)生[22-23]。房顫患者中miRNA-328表達(dá)增強(qiáng)，其作用靶點是編碼L-型鈣通道的CACNA1C和CACNB1，此外miRNA-328水平的升高可減少鉀內(nèi)流和縮短動作電位間期APD，導(dǎo)致心律失常發(fā)生的可能。另外，AF患者心房組織中miRNA-499上調(diào)，有利于AF電生理重構(gòu)，其靶基因是編碼SK3(人類弱傳導(dǎo)鈣激活鉀通道蛋白hsKCa3)的KCNN3(Ca2+激活K+通道蛋白基因3)[24-25]。

3 miRNA的臨床應(yīng)用

3.1 miRNA穩(wěn)定性與檢測方法 由于難于獲取心臟組織，miRNA的檢測主要依賴于外周血液標(biāo)本。miRNA在血漿、血清和尿液中的穩(wěn)定性非常好。Mitchell等[26]和Tijsen等[27]發(fā)現(xiàn)血漿室溫放置24 h或反復(fù)凍融8次，或極端pH(pH=1和pH=13)處理3 h和DNA酶(DNase)處理3 h，對血漿中內(nèi)源miRNA分子幾乎沒有影響。而其他大多數(shù)RNAs在這些條件下一般都會被降解。另外，Chen等[4]采用RT-PCR方法從肺癌A549細(xì)胞提取的RNA中隨機(jī)擴(kuò)增出一些miRNA，RNase處理3 h后，仍可以檢測到半數(shù)以上的miRNA，而對照的大分子RNA(18S rRNA、28S rRNA、GAPDH、β-actin、U6)則被迅速降解，顯示了血漿、血清等體液中的miRNA 作為理想的疾病標(biāo)志物所需的某些特征。血漿中RNA耐受RNase降解的可能機(jī)制：(1)RNA可能與DNA退火，使得它們既耐受DNase降解又能耐受RNase降解；(2)RNA可能被包入脂質(zhì)或脂蛋白復(fù)合物內(nèi)而受到保護(hù)；(3)RNA可能是通過化學(xué)修飾或者和蛋白結(jié)合而受到保護(hù)。

循環(huán)miRNA檢測通常包括：miRNA的提取,可用Trizol LS或離心柱法分離純化；反轉(zhuǎn)錄；熒光定量PCR。目前miRNA檢測的qRT-PCR方法主要是基于莖-環(huán)的RT-PCR方法和基于poly(A)加尾的RT-PCR方法。這兩種方法均可以采用Taqman探針或者SYBR熒光染料，前者特異性更高，后者通用性好。

3.2 miRNA臨床診斷 miRNA的表達(dá)具有組織特異性，臨床可通過測定miRNA水平來早期診斷或鑒別診斷疾病。血漿中miRNA水平對心臟疾病的診斷已多有報道[10-15]。Corsten等[28]分別在AMI、病毒性心肌炎、擴(kuò)張型心肌病和急性心力衰竭患者中進(jìn)行了心臟相關(guān)miR(miR1、miR133a、miR208b、miR499)，纖維化相關(guān)miR(miR21、miR29b)和炎性相關(guān)miR(miR146、miR155、miR223)的研究，發(fā)現(xiàn)相對于健康對照組來說，AMI患者miR208b和miR499分別呈1 600倍和100倍升高，并與肌鈣蛋白T(cTnT)相關(guān)，說明其從受損心肌細(xì)胞釋放；在病毒性心肌炎中二者分別呈30倍和6倍升高；在心衰患者中則呈現(xiàn)2倍左右升高；在擴(kuò)張性心肌病中未發(fā)現(xiàn)變化。同時炎癥相關(guān)miRNA并未發(fā)現(xiàn)明顯升高。

Tijsen等[27]證實了血漿miRNA-423-5p的水平可作為心力衰竭的又一項診斷指標(biāo)，血漿中的miRNA可評估心臟疾病的嚴(yán)重程度和預(yù)后。比如，血漿miRNA-30c和血漿miRNA-145與cTnT水平顯著相關(guān)，可用來反映梗死面積，繼而判斷心肌梗死嚴(yán)重程度和預(yù)后[29-30]。

3.3 miRNA臨床治療 miRNA在心血管疾病的病理生理學(xué)的作用普遍存在，不論是上調(diào)或下調(diào)可作為介入治療的靶點。目前在治療上的方法主要有兩大類：一是增強(qiáng)miRNA表達(dá)方面的功能獲得性研究，如設(shè)計合適的病毒載體，最為有用的是腺相關(guān)病毒(AAVs)，其方法是通過導(dǎo)入感興趣的miRNA片段到載體中，AAVs特定的血清型與心肌細(xì)胞高度親和并具低免疫原性，使得它們適于將核酸傳遞給心肌細(xì)胞達(dá)治療目的。二是miRNA功能抑制性方法研究，利用miRNA反義寡核苷酸如2-O-甲基修飾的寡核苷酸，通常將其命名為miRNA拮抗劑antagmomir，結(jié)構(gòu)上與miRNA互補(bǔ)結(jié)合抑制其功能。同樣作用的還有鎖核苷酸(LNA)和miRNA“海綿”。雖然從理論上來說，上述方法可直接調(diào)整miRNA水平進(jìn)而影響其功能，但miRNA與靶mRNA不是一一對應(yīng)的關(guān)系，一個miRNA可以調(diào)控不同的mRNA的表達(dá)，而多個miRNA可以調(diào)控同一個mRNA的表達(dá)。如上調(diào)miRNA-133可改善心肌肥大，但另一方面卻容易導(dǎo)致心律失常。如何使miRNA治療方法最優(yōu)化服務(wù)臨床，還任重道遠(yuǎn)[31]。

4 小 結(jié)

miRNA是近5年來生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)界的明星分子，其作為新的疾病診斷標(biāo)志物，非常值得關(guān)注與期待。許多疾病以一種或多種miRNA表達(dá)異常為特征，確定組織或者血漿中表達(dá)量異常的miRNA種類，對于疾病的早期診斷和鑒別診斷都有重要作用。近年來對 miRNA 的研究已取得重大進(jìn)展，越來越多的 miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，生物學(xué)功能也逐漸得到闡明，但是 miRNA在心血管疾病中的功能及其作用機(jī)制仍有待探討，在疾病進(jìn)程中循環(huán)miRNA譜發(fā)生改變的機(jī)制目前仍不十分明確，因此探求在特定組織或細(xì)胞中富集表達(dá)的miRNA，對于尋求組織損傷性疾病的血清miRNA標(biāo)志物，探討miRNA在心血管疾病中的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制及基因治療方面具有積極意義。

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A

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2015-02-02

2015-05-05)

△通訊作者，E-mail：zhuzheny@mail.sysu.edu.cn。