高強(qiáng)度聚焦超聲阻滯腰交感神經(jīng)節(jié)對(duì)后肢動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型脊髓P物質(zhì)和外周血β-內(nèi)啡肽的影響

傅 洪，魏安寧，李發(fā)琪，王智彪

(1.重慶市中醫(yī)院麻醉科 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲生物醫(yī)學(xué)工程研究所，重慶 400016)

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·論 著·

高強(qiáng)度聚焦超聲阻滯腰交感神經(jīng)節(jié)對(duì)后肢動(dòng)脈閉塞動(dòng)物模型脊髓P物質(zhì)和外周血β-內(nèi)啡肽的影響

傅 洪1，魏安寧2，李發(fā)琪3，王智彪3

(1.重慶市中醫(yī)院麻醉科 400021；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院麻醉科，重慶 400010；3.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲生物醫(yī)學(xué)工程研究所，重慶 400016)

目的 探討高強(qiáng)度聚焦超聲(HIFU)行腰交感神經(jīng)節(jié)阻滯對(duì)周圍動(dòng)脈閉塞動(dòng)物血漿β-內(nèi)啡肽(β-EP)及脊髓P物質(zhì)(SP)的影響。方法 26只家犬按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為三組：HIFU治療組(A組,n=12)，非治療組(B組,n=12)，正常對(duì)照組(C組,n=2)。A、B兩組建立后肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ?A組術(shù)后2周采用HIFU阻滯第2～6腰交感神經(jīng)節(jié)，B組不予處理。A、B兩組每次隨機(jī)選2只犬在治療后不同時(shí)間點(diǎn)采用放射免疫法檢測(cè)血漿β-EP，取腰段脊髓行免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)SP變化；C組直接檢測(cè)。結(jié)果 (1)A、B兩組在造模后2周血漿β-EP水平均低于C組(P<0.01)，治療后A組不同時(shí)間點(diǎn)β-EP水平高于B組(P<0.05)。(2)脊髓SP陽(yáng)性表達(dá)主要分布在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ?qū)?。A、B兩組在造模后2周脊髓腰段SP的OD值明顯高于C組(P<0.01)，HIFU干預(yù)后A組脊髓腰段SP的OD值低于B組(P<0.05)。(3)犬周圍動(dòng)脈閉塞缺血后血漿β-EP與脊髓SP的變化呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 HIFU阻滯腰交感神經(jīng)節(jié)治療慢性周圍動(dòng)脈閉塞缺血?jiǎng)游锬Ｐ停捎行哐獫{β-EP水平和降低脊髓SP水平，提高痛覺閾值，減輕疼痛。

后肢動(dòng)脈閉塞； 腰交感神經(jīng)節(jié)阻滯； P物質(zhì)； β-內(nèi)啡肽； 疼痛

高強(qiáng)度聚焦超聲 (HIFU)具有熱效應(yīng)(10 s內(nèi)，焦閾溫度可超過70 ℃)和空化效應(yīng)及無(wú)創(chuàng)、精確、可重復(fù)、對(duì)大血管影響小等特點(diǎn)，在一定條件下處理機(jī)體組織可達(dá)到徹底阻滯的效果。有研究在國(guó)內(nèi)開展了HIFU作用于神經(jīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明HIFU能夠阻斷兔坐骨神經(jīng)及腹腔神經(jīng)節(jié)的傳導(dǎo),并且阻滯程度與劑量呈量效關(guān)系[1-2]。傅洪等[3-4]首次報(bào)道了利用HIFU實(shí)現(xiàn)體外毀損犬腰交感神經(jīng)節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究，本研究擬在此基礎(chǔ)上，觀察HIFU治療后一定時(shí)間內(nèi)血漿β-內(nèi)啡肽(β-EP)及脊髓P物質(zhì)(SP)的改變并分析其相關(guān)性，從而在分子層面了解腰交感神經(jīng)阻滯(LSGB)的影響，揭示HIFU治療周圍動(dòng)脈閉塞缺血性疾病及其疼痛可能的作用機(jī)制，為其臨床中的應(yīng)用提供理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 選擇健康成年雜種犬26只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，體質(zhì)量13～16 kg，隨機(jī)分為三組：治療組(A組，n=12)；非治療組(B組，n=12)；正常對(duì)照組(C組，n=2)。

1.2 試劑與儀器 (1)846合劑，由長(zhǎng)春軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)，批號(hào)吉獸藥試字(2008)005013；(2)血漿β-EP試劑盒由第二軍醫(yī)大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)教研室提供；(3)SP試劑盒購(gòu)于中杉金橋生物技術(shù)有限公司(北京)；(4)SABC免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB顯色劑均購(gòu)于博士德生物技術(shù)工程有限公司(武漢)；(5)高強(qiáng)度聚焦超聲腫瘤治療機(jī)(重慶海扶公司，型號(hào)JC，0～15 000 W 可調(diào))。

1.3 方法

1.3.1 A組和B組均按文獻(xiàn)[5]建立下肢缺血?jiǎng)游锬Ｐ?術(shù)前常規(guī)禁食12 h，禁飲6 h，846合劑(0.15 mL/kg)麻醉起效后，仰臥、四肢外展并固定，腹股溝區(qū)常規(guī)消毒鋪巾；沿左股動(dòng)脈行徑逐層切開分離，游離出股動(dòng)脈，結(jié)扎、切斷其所有分支，20 G留置針于股動(dòng)脈向遠(yuǎn)心端穿刺，置入螺旋狀金屬絲(長(zhǎng)20 cm,外徑0.8 mm)1根并縫合固定，縫扎股動(dòng)脈切口使其縮窄一半，逐層縫合。造模后第8天A、B兩組經(jīng)腹應(yīng)用銀夾標(biāo)識(shí)左側(cè)第2～6腰交感神經(jīng)節(jié)，標(biāo)記后7 d A組在麻醉狀態(tài)下應(yīng)用HIFU治療機(jī)對(duì)第2～6腰交感神經(jīng)節(jié)分別處理300 s，處理聲強(qiáng)為2 123 W/cm2，術(shù)中均以青霉素靜脈滴注。

1.3.2 血漿及脊髓標(biāo)本制備 待動(dòng)物完全麻醉后,(1)抽右側(cè)股靜脈血4 mL即刻注入含0.3 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉40 μL和抑肽酶2 000 U預(yù)冷塑料試管內(nèi)，4 ℃離心后取上清液，保存于-40 ℃冰箱。(2)迅速開胸，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，剪開右心耳，予以生理鹽水灌注至流出液清亮，再灌注40 g/L多聚甲醛(pH=7.4)固定1 h后,取材患側(cè)L1～L5脊髓置入40 g/L多聚甲醛中固定4 h，后投入200 g/L蔗糖液中過夜。冷箱中對(duì)標(biāo)本進(jìn)行20 μm連續(xù)切片。

1.3.3 檢測(cè)方法 (1)血漿β-EP用放射免疫法測(cè)定；(2) 脊髓SP免疫組織化學(xué)測(cè)定：參照SABC免疫組織化學(xué)試劑盒中流程要求操作，滴加一抗?jié)舛葹?∶500，DAB顯色，復(fù)染后封片。另以PBS和10%山羊血清替代第一抗，分別作為陰性對(duì)照和替代對(duì)照。OlymPus BX50顯微鏡觀察染色結(jié)果并攝片。使用定量顯微鏡570(Leica)圖像分析軟件測(cè)量SP陽(yáng)性區(qū)平均光密度。每側(cè)背角高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別測(cè)定SP陽(yáng)性表達(dá)OD值并計(jì)算均值。

2 結(jié) 果

2.1 血漿β-EP水平變化 A組2只動(dòng)物分別于造模后6 d和治療后4 d死亡，B組1只在造模后9 d死亡。A組存活10只與B組存活11只動(dòng)物在造模后2周(治療0周)β-EP水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均低于C組(P<0.05)。治療1周后A組β-EP水平逐漸升高，并在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與B組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，并且隨時(shí)間推移，至治療后4周基本達(dá)到造模前水平(P>0.05)，而B組呈下降趨勢(shì)，2周時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

2.2 脊髓SP的分布及水平變化 脊髓SP陽(yáng)性表達(dá)主要分布在脊髓背角Ⅰ、Ⅱ?qū)?，呈棕黃色顆粒狀、條索狀和串珠狀分布，對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)少。A、B兩組在造模后2周脊髓腰段SP的OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均明顯高于C組(P<0.05)。治療1周后A組SP的OD值逐漸下降，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)與B組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著時(shí)間的推移，至2周時(shí)基本達(dá)到造模前水平(P>0.05)；而B組呈上升趨勢(shì)，4個(gè)月時(shí)上升最明顯(P<0.05)。見表2。

表1 三組各時(shí)點(diǎn)血漿β-EP水平比較

注：與C組相比，△P<0.05；同時(shí)點(diǎn)與B組相比，*P<0.05；-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

表2 三組脊髓背角SP的OD值在不同時(shí)點(diǎn)的變化

注：與C組相比，△P<0.05；同時(shí)點(diǎn)與B組相比，*P<0.05;-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

2.3 血漿β-EP與脊髓SP的關(guān)系 血漿β-EP與脊髓SP呈明顯負(fù)相關(guān)，A組r=-0.628，P<0.05；B組r=-0.701，P<0.01。

3 討 論

周圍動(dòng)脈閉塞性疾病是臨床常見疾病，70歲以上老年人發(fā)病率達(dá)15%～20%[5-6]。臨床癥狀主要表現(xiàn)為5P征，其中疼痛(短距離運(yùn)動(dòng)痛甚至靜息痛)表現(xiàn)尤為明顯，治療原則為控制病因、改善和增進(jìn)下肢血液循環(huán)[7]。研究表明，腰交感神經(jīng)鏈具有收縮血管、增加血管阻力及減少血流量等作用，腰交感神經(jīng)切除術(shù)因能消除動(dòng)脈痙攣使機(jī)體血管擴(kuò)張、改善患肢局部的血供，是目前此類疾病的有效治療措施[2,8-10]。

SP和β-EP均為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中調(diào)控疼痛的重要物質(zhì)。SP作為痛感遞質(zhì)，不但具備多種生物學(xué)效應(yīng)，如導(dǎo)致疼痛、降低血壓、擴(kuò)張血管和毛細(xì)血管通透性增加等[11]，而且在高級(jí)神經(jīng)中樞及其下行調(diào)制中發(fā)揮鎮(zhèn)痛功能[12]。SP及其受體豐富地分布在脊髓Ⅰ、Ⅱ和Х層。內(nèi)源性阿片肽有三大家族成員，其中β-EP具有強(qiáng)烈的麻醉鎮(zhèn)痛作用[13]。在一項(xiàng)橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)慢性神經(jīng)性疼痛患者腦脊液和血漿中β-EP水平明顯低于正常健康者，β-EP水平的降低導(dǎo)致痛域降低，反而增加對(duì)疼痛的敏感性[14]。另一項(xiàng)對(duì)偏頭痛患者配對(duì)治療的研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛患者，尤其是慢性偏頭痛患者，其基礎(chǔ)血漿β-EP水平較低，經(jīng)治療后偏頭痛癥狀改善，β-EP水平增加[15]。本研究觀察到下肢缺血模型建成后，動(dòng)物活動(dòng)性降低，還存在不同程度跛行，結(jié)果中發(fā)現(xiàn)動(dòng)物模型組(A、B兩組)血漿β-EP水平明顯低于正常對(duì)照組，而腰段脊髓SP的OD值明顯高于對(duì)照組，經(jīng)HIFU治療后血漿β-EP逐漸上升，而脊髓SP下降，與上述相關(guān)研究相仿。本研究還注意到，肢體慢性缺血時(shí)脊髓SP水平與血漿β-EP呈明顯負(fù)相關(guān)。其機(jī)制可能是缺血缺氧導(dǎo)致感覺神經(jīng)末梢刺激增加，繼而引發(fā)疼痛，急性期時(shí)，脊髓釋放的SP和降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)共同進(jìn)入血，誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞釋放一氧化氮(NO)，NO作用于血管產(chǎn)生舒張平滑肌、增加血流量等效應(yīng)，進(jìn)而引起后角P物質(zhì)產(chǎn)生減少[16]。與此同時(shí)，中樞性鎮(zhèn)痛物質(zhì)β-EP釋放增加，不但產(chǎn)生比等量嗎啡強(qiáng)20倍的直接鎮(zhèn)痛作用[17]，還通過抑制P物質(zhì)的釋放和交感神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)及其介質(zhì)的釋放發(fā)揮間接鎮(zhèn)痛作用[18]。在疼痛的慢性期，β-EP水平的升高減少脊髓P物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致脊髓后角P物質(zhì)積聚，SP通過負(fù)反饋抑制中樞β-EP的釋放，降低血漿中的β-EP水平。HIFU阻滯腰交感神經(jīng)節(jié)治療，一方面使機(jī)體血管擴(kuò)張，改善局部的血供，減輕炎性反應(yīng)和對(duì)痛覺神經(jīng)末梢的參加，另一方面促進(jìn)神經(jīng)末梢CGRP和SP釋放增加，通過正反饋進(jìn)一步促進(jìn)β-EP釋放，終止了缺血疼痛的惡性循環(huán)，降低脊髓后角SP水平，β-EP也逐漸恢復(fù)至接近正常水平[19]。

總之，HIFU阻滯腰交感神經(jīng)節(jié)治療慢性周圍動(dòng)脈閉塞缺血?jiǎng)游锬Ｐ停捎行哐獫{β-EP水平和降低脊髓SP水平，提高痛覺閾值，減輕疼痛。而有關(guān)治療的詳細(xì)分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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Effect of lumbar sympathetic ganglion blocking with high intensity focused ultrasound on substancep of spinal cord and β-endorphine of peripheral blood in hind limb arterial occlusion animal model

FUHong1,WEIAn-ning2,LIFa-qi3,WANZi-biao3

(1.DepartmentofAnesthesiology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China;2.DepartmentofAneshesiology,SecondAffilialedHospitalChongqing400010,China;3.UtrasoundBiomedicdEngineeringResearchInstitute,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

Objective To observe the effect of lumbar sympathetic ganglion blocking with high intensity focused ultrasound(HIFU)on substance P(SP)of spinal cord and β-endorphine(β-EP)in blood plasma in arterial occlusion animal model.Methods 26 canis familiaris were randomly assigned to 3 groups:HIFU therapy group (group A，n=12),non-therapy group (group B，n=12) and normao control group (group C，n=2).In group A and B,the arteria cruralis was liberated and all branches (including arteria profunda femoris) were cutted,then a helical tinsel was inserted into the arteria.In group A,the 2nd ～ 6th ganglion sympatheticums were blocked with HIFU after postoperative 2 weeks.In every time point after the therapy,2 dogs were randomly selected from groups A and B every time for β-EP examination,and then the spinal cord SP was detected,dogs in group C were directly detected.Results (1) Comparison with the group C,β-EP in the groups A and B was significantly decreased (P<0.01),β-EP in the group A was higher than that in the group B after therapy(P<0.05).(2) In the groups A and B,SP was located in the I,Ⅱ layers of dorsal horn in spinal cord,postoperative average optical density(OD) of SP was significantly higher than that in the group C (P<0.01);the OD in the group A was less than that in the group B after therapy (P<0.05).(3) In the model dog of arteria occlusion,blood plasma β-EP was negative correlated with the SP in the spinal cord.Conclusion Lumbar sympathetic ganglion blocking for hind limb arterial occlusion animal model by HIFU can increase blood plasma β-EP and decrease SP of spinal cord,and elevate the pain threshold value and then relieve pain.

hind limb aterial occlusive; lumbar sympathetic ganglion blocking; substance P； β-EP； pain

傅洪，男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事臨床麻醉與疼痛治療。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.014

A

1672-9455(2015)13-1852-03

2015-03-20

2015-05-15)