某市苗族、侗族及漢族乙型肝炎病毒基因分型及耐藥基因檢測(cè)

歐 陽(yáng),陳 玲,丁顯平

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州凱里 556000)

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·論 著·

某市苗族、侗族及漢族乙型肝炎病毒基因分型及耐藥基因檢測(cè)

歐 陽(yáng)1,2,陳 玲2,丁顯平1△

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/特色生物資源研究與利用川渝共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州凱里 556000)

目的 研究凱里市苗族、侗族及漢族乙型肝炎病毒(HBV)的基因分型和耐藥基因變異狀況。方法 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和基因芯片反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)凱里市苗族、侗族及漢族293例乙型肝炎患者基因型和對(duì)拉米夫定、阿德福韋耐藥突變基因型。用試劑盒自帶的陰性、陽(yáng)性對(duì)照作為每次測(cè)定的質(zhì)控,確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果 (1)HBV基因型檢測(cè)到B型及C型,其中B型259例(88.4%),C型25例(8.5%),無(wú)法分型9例(3.1%)。漢族B基因型比例低于苗族和侗族，C基因型比例明顯高于其他2個(gè)民族，其基因型分布與其他少數(shù)民族比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.55，P<0.01)；(2)286例對(duì)拉米夫定敏感，7例對(duì)拉米夫定耐藥；7例對(duì)拉米夫定耐藥的突變基因中，為苗族和漢族患者，侗族未見(jiàn)拉米夫定耐藥。但3個(gè)民族HBV耐拉米夫定變異檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.20，P>0.05)。所有293例患者均對(duì)阿德福韋敏感。結(jié)論 凱里市HBV基因型以B型為主；HBV基因B型患者易對(duì)拉米夫定耐藥，且以突變基因型以180M和204V為主。

乙型肝炎病毒； 基因型； 耐藥基因； 基因芯片

乙型肝炎病毒(HBV)有8種不同的基因型包括A～H[1-2]，近年又有報(bào)道發(fā)現(xiàn)新的I型和J型[3-4]。人類感染HBV基因型的類別有可能與疾病的感染譜、疾病的進(jìn)展、感染途徑有一定的聯(lián)系[5]，HBV基因容易發(fā)生基因的進(jìn)化和基因的遺傳變異[6]。HBV基因型耐藥動(dòng)態(tài)檢測(cè)以及耐藥性突變的頻率差異對(duì)乙型肝炎抗病毒治療藥物療效評(píng)價(jià)具有重要的指導(dǎo)意義。為了解凱里市苗族、侗族及漢族的HBV基因分型和耐藥基因變異狀況，本文采用了膜基因芯片技術(shù)對(duì)凱里市苗族患者96例、侗族患者89例、漢族患者108例的HBV基因型和耐藥變異進(jìn)行了檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 所有患者均來(lái)自貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，且乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性。其中苗族96例，平均年齡(38±17)歲，男51例，女45例；侗族89例，平均年齡(32±14)歲，男48例，女41例；漢族108例,其中男79例,女29例,平均年齡(35±13)歲?；颊咴\斷符合2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的“慢性乙型肝炎防治指南”診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均未經(jīng)拉米夫定等藥物抗病毒治療，血清甲、丙、戊、庚型肝炎病毒均為陰性。

1.2 試劑 乙型肝炎標(biāo)志物(包括乙型肝炎表面抗原、表面抗體、e抗原、e抗體和核心抗體)檢測(cè)試劑盒由廈門新創(chuàng)公司提供，批號(hào)20131123；甲、丙、戊、庚型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒由廈門新創(chuàng)公司提供，批號(hào)201301031；乙型肝炎病毒DNA熒光定量檢測(cè)試劑盒由深圳匹基有限公司提供，批號(hào)20131203；HBV基因分型及耐藥變異檢測(cè)試劑盒由深圳亞能科技有限公司提供，批號(hào)20140101。

1.3 儀器 HBV DNA檢測(cè)用熒光聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(由杭州博日科技有限公司提供)；基因分型及耐藥變異檢測(cè)用Rotor-GeneQ 凱杰實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(由德國(guó)凱杰公司提供)；FYY-3型雜交儀(興化市分析儀器廠生產(chǎn))。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)本采集空腹采集慢性乙型肝炎患者抗凝靜脈血3 mL，3 000 r/min，離心10 min，分離血清置1.5 mL離心管中4 ℃或-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 熒光定量PCR檢測(cè)HBV DNA采用德國(guó)凱杰有限公司提供試劑盒，DNA提取采用煮沸法：取血清100 μL加入100 μL DNA提取液，混勻后離心10 min，棄上清液，加入25 μL DNA裂解液，放置10 min混勻，100 ℃煮沸10 min，離心取上清液2 μL放入裝有生物素標(biāo)記引物的PCR反應(yīng)管中加入2 μL已處理好的標(biāo)本，按下列條件擴(kuò)增：37 ℃ 5 min，94 ℃預(yù)變性1 min，然后按95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.4.3 對(duì)復(fù)檢表面抗原陽(yáng)性者進(jìn)行HBV DNA熒光定量，對(duì)熒光定量大于1×104copy/mL者進(jìn)行基因分型及耐藥變異檢測(cè)?；蛐酒聪虬唿c(diǎn)雜交檢測(cè)采用深圳亞能生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品?；蛐酒聪虬唿c(diǎn)雜交PCR擴(kuò)增DNA提取采取柱層析法：取1.5 mL離心管，加入20 μL蛋白酶K，再加入200 mL血清和200 μL裂解液，混勻后放入56 ℃恒溫裂解10 min，裂解完成后加入300 μL無(wú)水乙醇，混勻。取離心柱置于收集管內(nèi)，轉(zhuǎn)移1.5 mL離心管內(nèi)的樣本處理液到離心管內(nèi)，蓋上管蓋，1 200 r/min離心1 min，棄濾液，加入700 μL洗液Ⅰ(已加入13 mL無(wú)水乙醇),1 200 r/min離心1 min，棄濾液，加入700 μL洗液Ⅱ,1 200 r/min離心1 min，棄濾液，1 400 r/min離心2 min，棄收集管，將離心柱置于干凈的1.5 mL離心管中，開(kāi)蓋室溫放置5 min，加入50 mL洗脫液，蓋上管蓋室溫靜置3 min，800 r/min離心2 min。取3 μL用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增完成后，PCR產(chǎn)物煮沸變性10 min，加入反應(yīng)膜條置42 ℃雜交2 h。用洗脫液洗膜2次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，最后用NBT/BCIP系統(tǒng)顯色，根據(jù)紫色斑點(diǎn)出現(xiàn)的位置和順序直接判斷結(jié)果。用試劑盒自帶的陰性、陽(yáng)性對(duì)照作為每次測(cè)定的質(zhì)控,確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4.4 結(jié)果判斷 基因分型及耐藥變異檢測(cè)采用膜芯片反向點(diǎn)雜交方法，用生物素-親和素酶聯(lián)反應(yīng)顯色，在進(jìn)行B、C、D分型的同時(shí)檢測(cè)拉米夫定和阿德福韋2種藥物的5個(gè)常見(jiàn)耐藥突變位點(diǎn)。如果質(zhì)控位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色表示該結(jié)果有效，在某一基因型檢測(cè)位點(diǎn)顯色表明該HBV為相應(yīng)的基因亞型，只在藥物敏感位點(diǎn)出現(xiàn)顯色點(diǎn)表示HBV對(duì)該藥敏感，一旦在耐藥位點(diǎn)出現(xiàn)顯色點(diǎn)即表示耐藥。

1.4.5 其他(甲、丙、戊、庚)型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒由廈門新創(chuàng)公司提供，具體操作按照說(shuō)明書(shū)。

1.4.6 乙型肝炎標(biāo)志物采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)，試劑盒由北京科美公司提供，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 293例乙型肝炎患者HBV基因分型及分布 苗族以B型為主,其次為C型;侗族以B型為主,其次為C型，漢族以B型和C型為主。在3個(gè)民族中未發(fā)現(xiàn)除B、C基因型以外的其他HBV基因型。見(jiàn)表1。

表1 侗族、苗族與漢族慢性乙型肝炎患者基因型分布情況[n(%)]

注：與苗族、侗族相比，χ2=15.55，*P<0.01。

2.2 293例乙型肝炎患者HBV基因分型分布比較 本地區(qū)HBV基因型檢測(cè)到B型以及C型,其中B型259例(占88.4%),C型25例(占8.5%),無(wú)法分型9例(占3.1%)。由表2可以看出苗族、侗族和漢族中B基因型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，但漢族B基因型比例低于苗族和侗族，C基因型比例明顯高于其他2個(gè)民族，其基因型分布與其他少數(shù)民族比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.55，P<0.01)，3個(gè)少數(shù)民族均發(fā)現(xiàn)有少量的未分型HBV感染。

2.3 293例乙型肝炎患者耐藥突變情況 293例乙型肝炎患者中，286例對(duì)拉米夫定敏感，7例對(duì)拉米夫定耐藥；7例對(duì)拉米夫定耐藥的突變基因型中，為苗族和漢族患者，侗族未見(jiàn)拉米夫定耐藥。突變基因型以180M和204V為主,但3個(gè)民族HBV耐拉米夫定變異檢出率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.20，P>0.05)。所有患者均對(duì)阿德福韋敏感，未檢測(cè)出耐藥突變基因型。見(jiàn)表2。

表2 7例拉米夫定耐藥突變基因型[n(%)]

注：3個(gè)民族相比，χ2=3.20，P>0.05。

3 討 論

目前人類已發(fā)現(xiàn)的HBV基因型共8種即A～H。由于HBV變異進(jìn)化后使得HBV在自然感染過(guò)程中反映了不同基因型的變異特點(diǎn)。HBV感染后的臨床過(guò)程有很多種，不僅宿主的感染方式和宿主的免疫狀況有關(guān)，還與感染HBV株的基因型種類有關(guān)[8-9]。近幾年來(lái)，大批學(xué)者發(fā)現(xiàn)HBV基因型具有地理區(qū)域性分布特征[10-12]，各地區(qū)優(yōu)勢(shì)基因型不同，病毒株也有很大差異，預(yù)后也各不一樣，所以基因分型的檢測(cè)在流行病學(xué)上對(duì)傳染源的追蹤研究和傳播途徑具有很重要的意義。

在我國(guó)以C型和B型為主[13-17]，其中南方地區(qū)以B型為主，北方地區(qū)以C型為主。本次檢測(cè)到該地區(qū)乙型肝炎患者HBV基因型存在B型及C型,其中B型259例(88.4%),C型25例(8.5%),無(wú)法分型9例(3.1%)。無(wú)其他明確型別及混合型，有4例漢族、3例苗族患者無(wú)法分型,可能為其他基因型的HBV感染，因采用的試劑盒檢測(cè)探針是針對(duì)我國(guó)比較常見(jiàn)的B型、C型和D型設(shè)計(jì)的，而對(duì)少見(jiàn)的其他基因型不能檢出。檢測(cè)中以B型為優(yōu)勢(shì)基因，占總體標(biāo)本的88.4%,其中苗族患者病毒B基因型占苗族標(biāo)本的94.8%，侗族患者病毒B基因型占侗族標(biāo)本的91.0%，漢族組B基因型占漢族標(biāo)本的80.6%,漢族與苗族和侗族比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本研究提示貴州省凱里市的侗、苗族及漢族乙型肝炎患者HBV基因型以B型為主,C型較少，與丁靜娟等[13]報(bào)道一致。

目前治療乙型肝炎的主要藥物有阿德福韋、拉米夫定、干擾素等。越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注感染HBV不同基因型的患者對(duì)抗病毒治療反應(yīng)的差異。拉米夫定作為乙型肝炎一線抗病毒治療藥物，主要耐藥機(jī)理是HBV DNA聚合酶基因發(fā)生突變，導(dǎo)致與拉米夫定的結(jié)合力降低，7例對(duì)拉米夫定耐藥的突變基因型中，突變基因型以180M和204V為主,使用過(guò)抗病毒藥物泛昔喏韋治療可引起180M突變，所以需要排除這個(gè)藥物的干擾。本次所有患者都無(wú)使用泛昔喏韋的病史。新型抗病毒藥物阿德福韋酯是繼拉米夫定后的新型抗病毒藥物，因?yàn)榕c其他核苷酸類似物無(wú)交叉耐藥而且近期使用耐藥率低，所以在抗HBV治療中起到很重要的作用。但有研究發(fā)現(xiàn),阿德福韋酯長(zhǎng)期使用也可導(dǎo)致HBV發(fā)生耐藥突變。目前已證實(shí)與阿德福韋酯耐藥相關(guān)的突變位點(diǎn)主要為rtA181和rtN236。卜范峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化、乙型肝炎E抗原陰性狀態(tài)、年齡和阿德福韋耐藥與拉米夫定耐藥變異發(fā)生明顯相關(guān)。但本文293例患者未檢測(cè)出阿德福韋耐藥突變基因型。雖然本次耐藥變異所占的比例較小，但對(duì)于即將進(jìn)行抗病毒治療或者治療后無(wú)作用的患者，有必要檢測(cè)HBV耐藥變異情況，便于指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理科學(xué)地制訂抗病毒治療方案，以便能達(dá)到更好的治療效果。

本研究表明，利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)HBV基因型及耐藥性發(fā)生與否，1次試驗(yàn)就能為乙型肝炎臨床診療提供多項(xiàng)參考信息。由于該方法具有高通量，快速靈敏，多個(gè)平行檢測(cè)基因的優(yōu)點(diǎn)，而且還可進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，提前發(fā)現(xiàn)，及時(shí)調(diào)整治療方案等目的，對(duì)于針對(duì)性指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義，因而在HBV基因分型和耐藥變異檢測(cè)中前景看好。目前有證據(jù)表明HBV基因型與疾病發(fā)展和臨床治療效果有著密切關(guān)系，在明確基因型后進(jìn)行抗病毒治療，可使抗病毒治療的方案?jìng)€(gè)體化，達(dá)到治療效果的最優(yōu)化。同時(shí)也可積累不同基因型在人類學(xué)、流行病學(xué)、病原學(xué)、臨床治療等方面的資料，為以后其它藥物治療乙型肝炎患者提供有效的、有意義的研究線索。

綜上所述，貴州省凱里市乙型肝炎患者HBV基因型以B型為主。乙型肝炎患者在抗病毒治療中應(yīng)監(jiān)測(cè)常見(jiàn)耐藥位點(diǎn)的突變，通過(guò)對(duì)長(zhǎng)期服用拉米夫定和阿德福韋酯藥物患者進(jìn)行HBV基因型檢測(cè)和耐藥突變，有助于了解不同基因型患者的HBV相關(guān)耐藥基因情況，便于抗病毒藥物的更換和選擇，為個(gè)體化抗病毒治療方案提供更有利的科學(xué)依據(jù)。

[1]焦敏，何江，余伍忠．PCR及其衍生技術(shù)在乙型肝炎病毒定量檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]．中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2010，(12)：9-11．

[2]La TG,Nicolotti N,De WC,et al.An assessment of the effect of hepatitis B vaccine in decreasing the amount of hepatitis B disease in Italy[J].Virol J,2008,5(1):84-90.

[3]Olinger CM,Jutavijittum P,Hubschen JM,et al.Possible new hepatitis B virus genotype,Southeast Asia[J].Emerg Infect Dis,2008,14(11):1777-1780.

[4]Tatematsu K,Tanaka Y,Kurbanov F,et al.A genetic variant of hepatitis B virus divergent from known human and ape genotypes isolated from a Japanese patient and provisionally assigned to new genotype J[J].J Virol,2009,83(20):10538-10547.

[5]楊柳，張紅梅，徐嬌陽(yáng)，等．新疆地區(qū)回族、漢族人群HBV基因分型的研究[J]．中國(guó)輸血雜志，2014，27(9)：936-939．

[6]于紅纓，邵凌云，符政遠(yuǎn)，等．湖南省懷化市少數(shù)民族及漢族慢性乙型肝炎患者病毒基因分型及臨床分析[J/CD]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志:電子版，2008，2(1)：44-49．

[7]賈繼東，李蘭娟．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]．胃腸病學(xué)，2011,10(6)：351-366．

[8]黃彬，陳茶，陳利達(dá)．乙型肝炎病毒基因型檢測(cè)及其臨床意義[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21(9)：1749-1751．

[9]段建平，朱坤，吳薇佳，等．乙型肝炎病毒基因型與YMDD基因區(qū)序列突變及BCP突變關(guān)系探討[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，34(1)：68-72．

[10]Biswas A,Panigrahi R,Pal M,et al.Shift in the hepatitis B virus genotype distribution in the last decade among the HBV carriers from eastern India:possible effects on the disease status and HBV epidemiology[J].J Med Virol,2013,85(8):1340-1347.

[11]Kurbanov F,Tanaka Y,Mizokami M.Geographical and genetic diversity of the human hepatitis B virus[J].Hepatol Res,2010,40(1):14-30.

[12]郭樂(lè)，申元英．中國(guó)少數(shù)民族HBV基因型地理分布研究進(jìn)展[J]．中國(guó)公共衛(wèi)生，2014，30(7)：962-964．

[13]丁靜娟，彭亮，張權(quán)，等．貴州侗族、苗族和漢族人群乙型肝炎病毒基因型分布[J]．中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2004，18(3)：230-233．

[14]王虹，馮妙芙，周東耀，等．熒光分子信標(biāo)探針檢測(cè)拉米夫定耐藥基因的研究[J]．中國(guó)生物工程雜志，2003，23(6)：90-93．

[15]劉建湘，蔣黎．戊型肝炎重疊慢性乙型肝炎病毒感染臨床分析[J]．中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(24)：76-78．

[16]艾敏，趙偉，陶晨，等．乙型肝炎病毒外膜大蛋白檢測(cè)在恩替卡韋抗病毒治療中的臨床意義[J]．江蘇醫(yī)藥，2012，38(23)：2809-2811．

[17]張曉平，邱麗影，秦俊生，等．深圳地區(qū)乙型肝炎病毒基因分型與核苷類藥物[J]．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，30(12)：4．

[18]卜范峰，魯艷芹，韓金祥，等．實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥突變及其與臨床指標(biāo)的相關(guān)性[J]．中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008，21(9)：806-809．

Genotyping and detection of drug resistance gene of hepatitis B virus among Miao,Dong and Han nationalities in a city

OUYang1,2,CHENLing2,DINGXian-ping1△

(1.BioresourceResearchandUtilizationJointKeyLaboratoryofSichuanandChongqing,CollegeofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610014,China;2.SecondAffiliatedHospitalofGuiyangMedicalCollege,Kaili,Guizhou556000,China)

Objective To research the genotyping and drug resistance gene mutation status of hepatitis Bvirus(HBV) among Miao,Dong and Han nationalities in Kaili city of Guizhou province.Methods The quantitative PCR and reverse dot blot hybridization microarray technology were adopted to detect the HBV genotypes and lamivudine,adefovir resistant mutations genotypes in 293 cases (Miao,Dong and Han nationalities) of hepatitis B.The negative control and positive control of the reagent kit served as the quality control in each determination for ensuring the accuracy of the results.Results (1) 259 cases of genotype B (259/293,88.4%) and 25 cases of genotype C (25/293,8.5%) were detected,and 9 cases(3.1%) were unable genotyping.A lower frequency of genotype B in Han population was found compared to Miao and Dong population and a higher frequency was seen in genotype C,resulting in statistical significance in genotyping distribution compared with other minorities(χ2=15.55，P<0.01).(2)286 cases were sensitive to lamivudine.7 cases showed lamivudine resistance,and all these 7 cases were Miao or Han patients without lamivudine resistance in Dong population,and lamivudine-resistant HBV mutation detection rate had no statistically significant difference among the three ethnic groups (χ2=3.20，P>0.05).All 293 patients were sensitive to adefovir.Conclusion Genotype B is the dominant HBV genotype in Kaili city.HBV genotype B patients easily become lamivudine-resistant and the mutant genotype mainly are 180M and 204V.

HBV； genotype； resistance gene； gene chip

歐陽(yáng)，女，本科，檢驗(yàn)師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

△通訊作者：E-mail:Brainding@scu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.011

A

1672-9455(2015)13-1845-03

2015-01-25

2015-03-08)