雙歧桿菌的脂磷壁酸對(duì)巨噬細(xì)胞MAPK的影響

李迎雪，宋 洋，姚 君，張 茹

(廣東省深圳市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 518020)

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雙歧桿菌的脂磷壁酸對(duì)巨噬細(xì)胞MAPK的影響

李迎雪，宋 洋，姚 君，張 茹

(廣東省深圳市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 518020)

目的 探討雙歧桿菌的脂磷壁酸(LTA)對(duì)巨噬細(xì)胞絲裂源活化蛋白激酶(MAPK)活性的影響。方法 選取6～8周齡巴比賽(BALB/c)小鼠90只，按隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法分為九組，每組10只，A組腹腔注射磷酸緩沖鹽溶液(PBS)；B組腹腔注射LTA；C組腹腔注射LTA+細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抑制劑；D組腹腔注射LTA+c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑；E組腹腔注射LTA+p38抑制劑；F組腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制劑組；G組腹腔注射LTA+ERK及P38抑制劑組；H組腹腔注射LTA+JNK及P38抑制劑；I組腹腔注射LTA+3種抑制劑。九組小鼠注射5 d，每天注射1次，飼養(yǎng)7 d后，處死全部小鼠，采用免疫印跡法檢測(cè)九組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK蛋白的磷酸化水平。結(jié)果 (1)B組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平較A組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞p38MAPK和JNK平均熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；(2)向小鼠腹腔注射抑制劑的其他七個(gè)組別，其相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平幾乎為零，且對(duì)其他蛋白表達(dá)無(wú)影響。結(jié)論 LTA可能是通過(guò)活化巨噬細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2來(lái)激活巨噬細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌細(xì)胞因子，抑制劑能夠有效阻斷蛋白表達(dá)通路，對(duì)其他蛋白表達(dá)無(wú)影響。

雙歧桿菌； 脂磷壁酸； 巨噬細(xì)胞； 絲裂源活化蛋白激酶

雙歧桿菌是黏附于人類(lèi)腸道最主要的細(xì)菌，是有益菌群之一，通過(guò)維持機(jī)體腸道內(nèi)菌群平衡來(lái)維護(hù)宿主的健康[1]。隨著醫(yī)療技術(shù)和微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們?cè)絹?lái)越重視對(duì)雙歧桿菌的研究。脂磷壁酸(LTA)是雙歧桿菌細(xì)胞壁的重要大分子，也是雙歧桿菌發(fā)揮其抗菌、抗衰老、抗腫瘤及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功效的重要結(jié)構(gòu)成分之一[2]。LTA是以1,3磷酸二脂鍵連接的而成的線性磷酸甘油多聚體，是一種無(wú)不良反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑[3]。巨噬細(xì)胞MAPK是由脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸、酪氨酸雙重磷化作用的蛋白激酶，ERK1/2和p38MAPK是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路中信號(hào)蛋白分子，MAPK對(duì)巨噬細(xì)胞具有活化、刺激作用，能夠有效地促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。研究表明，LTA能夠通過(guò)活化NF-кB、AP-1和MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK來(lái)激活巨噬細(xì)胞信息通道，促使巨噬細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，增強(qiáng)細(xì)胞毒作用，抑制體內(nèi)多種腫瘤的生長(zhǎng)[4-5]。為了解LTA激活巨噬細(xì)胞信息通道，分泌細(xì)胞因子的機(jī)制，筆者做了相關(guān)研究，通過(guò)觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2、p38MAPK和JNK的含量，來(lái)研究雙歧桿菌的LTA對(duì)巨噬細(xì)胞MAPK的影響機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 6～8周齡BALB/c小鼠90只，體質(zhì)量20～23 g，其中雌鼠45只，雄鼠45只(小鼠購(gòu)于河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.2 LTA提取 在LB培養(yǎng)基中接種雙歧桿菌，于37 ℃的無(wú)氧環(huán)境中培養(yǎng)，48 h后裂解，離心并收集上清液。上清液置入50 ℃的水浴鍋中恒溫，待上清液分層后收集上層溶液，用醋酸銨緩沖液洗脫溶液。

1.3 給藥方法 小鼠第1天，空腹注射10%硫乙醇酸鹽肉湯2 mL，第2天起，給予不同試劑。A組注射磷酸緩沖鹽溶液(PBS)0.2 mL,B組腹腔注射LTA；C組腹腔注射LTA +細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)抑制劑；D組腹腔注射LTA+ c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑；E組腹腔注射LTA+p38抑制劑；F組腹腔注射LTA+ERK及JNK抑制劑組；G組腹腔注射LTA+ERK及P38抑制劑組；H組腹腔注射LTA+JNK及P38抑制劑；I組腹腔注射LTA+3種抑制劑。1次/天，連用5 d(LTA劑量均為10 μg，3種抑制劑劑量均為0.2 mL，均購(gòu)于美國(guó)Selleck公司)。

1.4 巨噬細(xì)胞收集及培養(yǎng) 7 d后，處死小鼠，Hank′s液灌洗腹腔，收集灌洗液。將細(xì)胞數(shù)調(diào)至106/mL，取100 μL細(xì)胞懸液置于培養(yǎng)板中，37 ℃下5% CO2孵箱中培養(yǎng)2 h，加入100 μL的10%小牛血清的RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液和終極濃度為10 ng/mL脂多糖(LPS)，培養(yǎng)24 h后，置于-30 ℃環(huán)境中保存。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)九組小鼠p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的蛋白表達(dá) 離心收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入裂解液，于4 ℃水中冰浴30 min，1 200 r/min離心10 min，吸取上清液。BCA法進(jìn)行蛋白定量，后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠電泳分離，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，成像后分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 A、B兩組小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表達(dá)水平比較 經(jīng)LTA刺激后的B組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)水平較A組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞p38MAPK和JNK蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組小鼠巨噬細(xì)胞ERK1/2、p38和JNK蛋白表達(dá)水平比較情況

注：與A組比較，*P<0.05。

2.2 B、C、D、E四組小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2、p38和JNK的蛋白表達(dá)水平比較 與B組比較，加入ERK抑制劑的C組小鼠，ERK1/2蛋白磷酸化水平幾乎為零；加入JNK抑制劑的D組小鼠，JNK蛋白磷酸化水平幾乎為零；加入p38抑制劑的E組小鼠，p38蛋白磷酸化水平幾乎為零。見(jiàn)表2。

表2 B、C、D、E組小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白表達(dá)水平比較

2.3 F、G、H、I 四組小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白磷酸化水平表達(dá)比較 F組加入ERK和JNK抑制劑，其ERK1/2和JNK蛋白幾乎為零表達(dá)；G組和H組如同F(xiàn)組，加入抑制劑所對(duì)應(yīng)的蛋白磷酸化表達(dá)幾乎為零；I組加入3種抑制劑，則ERK1/2、JNK和p38蛋白幾乎為零表達(dá)。見(jiàn)表3。

表3 F、G、H、I組小鼠ERK1/2、p38和JNK蛋白表達(dá)水平比較情況

3 討 論

雙歧桿菌是動(dòng)物和人類(lèi)腸道中重要的生理性有益菌群，維護(hù)腸道菌群平衡及機(jī)體健康[6-8]。LTA是革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁內(nèi)的重要大分子結(jié)構(gòu)，其親水端參與細(xì)菌黏附定值作用，疏水端能夠與細(xì)胞膜緊密相連，LTA參與體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，激活局勢(shì)細(xì)胞吞噬能力，是無(wú)不良反應(yīng)的生物調(diào)節(jié)劑[9]。目前研究證實(shí)，雙歧桿菌的LTA通過(guò)激活巨噬細(xì)胞多種信息通道，活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力，降低消化道疾病發(fā)生，也為預(yù)防和治療胃腸道疾病提供重要依據(jù)，但對(duì)LTA促使巨噬細(xì)胞表達(dá)的機(jī)制目前尚未清楚[10]。

ERK通路、p38MAPK通路、JNK/SAPK通路及BMK通路這4條通路路可以介導(dǎo)多種細(xì)胞信號(hào)，演變?yōu)榧?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的匯聚通路[11-12]。MAPK能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)，介導(dǎo)p38MAPK激活，活化哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子家族(NF-кB)和鐵氧還蛋白轉(zhuǎn)錄類(lèi)似因子1(AP-1)，促使巨噬細(xì)胞的表達(dá)、合成和分泌白細(xì)胞介素1(IL-1)、白細(xì)胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α[13]。相關(guān)研究表明，諸多因子如集落刺激因子-1、前列腺素E2以及酵母多糖能夠活化巨噬細(xì)胞，其主要途徑是提高ERK1/2、p38MAPKA和AP-1的活性[14-15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)雙歧桿菌的LTA刺激后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK中ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯要高于注射PBS組，而A組和B組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞MAPK家族中p38MAPK和JNK水平無(wú)明顯差異，加入抑制劑的其他七組，其相應(yīng)的蛋白磷酸化表達(dá)均幾乎為零，這表明雙歧桿菌的LTA通過(guò)活化MAPK家族中ERK1/2激活小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌細(xì)胞因子，以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力；抑制劑能夠有效阻斷ERK1/2、JNK和p38通路，且抑制劑不能影響其他蛋白水平表達(dá)。但LTA對(duì)巨噬細(xì)胞MAPK家族中JNK和p38MAPK水平影響不大。

綜上所述，雙歧桿菌的LTA能夠通過(guò)活化巨噬細(xì)胞MAPK家族中ERK1/2水平，促進(jìn)巨噬細(xì)胞表達(dá)、合成和分泌IL-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α，增強(qiáng)其殺傷活性和細(xì)胞毒作用，為臨床預(yù)防和治療消化道疾病提供重要參考依據(jù)。

[1]楊林，王立生，崔忠林，等．雙歧桿菌對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞ERK1/2蛋白激酶通道的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17(2)：85-86．

[2]王玉林，王立生，朱惠明，等．雙歧桿菌DNA對(duì)巨噬細(xì)胞MAPK的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2005，17(4)：256-257．

[3]李多云，劉曉軍，程航，等．雙歧桿菌腸道內(nèi)調(diào)控表達(dá)腸道病毒71型VP1蛋白的實(shí)驗(yàn)研究[J]．中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2014，9(5)：422-426．

[4]李雪，王義乾，羅海華，等．NF-κB信號(hào)通路對(duì)BLP耐受巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)的影響[J]．中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志，2014，3(3)：300-305．

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[6]楊麗，劉志強(qiáng)，Chen X，等．?huà)雰弘p歧桿菌對(duì)花生過(guò)敏小鼠模型腸道Th2反應(yīng)的調(diào)節(jié)[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2012，24(8)：677-681．

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[8]崔樹(shù)娜，URSULA B．金雀異黃素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MAPK和TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014，30(3)：233-236．

[9]李迎雪，王立生，荀安營(yíng)，等．雙歧桿菌的完整肽聚糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞縫隙鏈接的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2008，20(3)：195-196．

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[11]李芙蓉，王躍，劉明方，等．雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)B16荷瘤小鼠NK細(xì)胞受體NKG2D及其配體的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(1)：16-19．

[12]丁培杰．雙歧桿菌脂磷壁酸對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬和NO釋放的影響[J]．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，38(6)：812-814．

[13]謝寧，郭斌，王躍，等．雙歧桿菌脂磷壁酸與5-氟尿嘧啶體內(nèi)聯(lián)用對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2009，21(12)：1090-1094．

[14]李迎雪，楊林，王立生，等．雙歧桿菌的完整肽聚糖對(duì)巨噬細(xì)胞AP-1的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2007，19(2)：129-131．

[15]馮聚玲，楊林，姚君，等．雙歧桿菌的完整肽聚糖對(duì)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響[J]．中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22(7)：577-579．

Effects of bifidobacterium lipoteichoic acid on macrophages MAPK*

LIYing-xue,SONGYang,YAOJun,ZHANGRu

(DepartmentofGastroenterology,ShenzhenMunicipalPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518020,China)

Objective To study the influence of bifidobacterium lipoteichoic acid (LTA) on macrophage mitogen activated protein kinase (MAPK) activity of macrophages.Methods 90 BALB/c mice with 6-8 weeks old were selected and randomly divided into 9 groups according to the random number table,10 mice per group.The group A was injected by phosphate buffer solution(PBS);the group B was intraperitoneally injected by LTA;the group C was intraperitoneally injected by LTA + ERK inhibition agent;the group D was intraperitoneally injected by LTA + JNK inhibitor;the group E was intraperitoneally injected by LTA + p38 inhibitors;the group F was intraperitoneally injected by LTA + ERK and JNK inhibitor;the group G was intraperitoneally injected by LTA + ERK and P38 inhibitor;the group H was intraperitoneally injected by LTA + JNK and P38 inhibitors;the group I was intraperitoneally injected by LTA + three kinds of inhibitors.9 groups were injected for 5 d,once a day.After 7 d feeding,the mice all were sacrificed.The phosphorylation levels of ERK1/2,p38MAPK and JNK protein in the peritoneal macrophages MAPK family were detected by using immunoblotting (Western blot).Results (1) The ERK1/2 protein phosphorylation levels of abdominal cavity macrophage in the group B was significantly increased compared with the group A,the difference was statistically significant (P<0.05);the abdominal cavity macrophage p38MAPK and JNK average fluorescence intensity had no statistical difference between these two groups (P>0.05);(2) In the other 7 groups,the corresponding protein expression levels were almost zero,moreover had no effect on the expression of other proteins.Conclusion LTA is probably to activate the macrophages to express,synthesize and secrete cytokines by activating ERK1/2 in macrophages MAPK family,inhibitor can effectively block the protein expression pathway without affecting the expression of other proteins.

bifidobacterium; lipoteichoic acid; macrophages; mitogen activated protein kinase

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201202125)。

李迎雪，女，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槲改c病學(xué)。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.13.002

A

1672-9455(2015)13-1821-03

2015-01-20

2015-03-10)