DNA測序法檢測CYP2C19基因多態(tài)性指導(dǎo)氯吡格雷用藥的臨床價值*

吳 薇，韓瑞玲，王麗岳，李 艷△

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430060；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心，湖北武漢 430060；3.武漢市普仁醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430081)

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·論 著·

DNA測序法檢測CYP2C19基因多態(tài)性指導(dǎo)氯吡格雷用藥的臨床價值*

吳 薇1,2，韓瑞玲1,2，王麗岳3，李 艷1,2△

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗科，湖北武漢 430060；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床分子診斷中心，湖北武漢 430060；3.武漢市普仁醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430081)

目的 評估DNA測序法檢測細胞色素氧化酶P450 2C19(CYP2C19)多態(tài)性以指導(dǎo)氯吡格雷臨床用藥。 方法 選取2010年11月至2013年11月武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科診斷為急性冠狀動脈綜合征，并首次接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)(PCI)的140例患者為研究對象，隨機分為試驗組及對照組各70例。試驗組采集外周血標本并提取基因組DNA，根據(jù)已知的CYP2C19基因序列，設(shè)計針對CYP2C19*2、CYP2C19*3位點的特異性引物，聚合酶鏈反應(yīng)擴增包含CYP2C19基因多態(tài)性位點的DNA片段；并以DNA測序法進行鑒定，分析不同CYP2C19基因型在試驗組患者中的分布頻率。對照組患者使用氯吡格雷藥物但未檢測相關(guān)基因。比較兩組患者隨訪過程中發(fā)生冠狀動脈血栓事件的差異。結(jié)果 DNA測序結(jié)果顯示，試驗組中共有4種基因型組合被檢測到：*1/*1(636GG，681GG)、*1/*2(636GG，681GA)、*2/*2(636GG，681AA)、*1/*3(636GA，681GG)，分布頻率分別為33例(47.1%)、29例(41.4%)、4例(5.7%)、4例(5.7%)，而*3/*3(636AA，681GG)和*2/*3(636GA，681GA)未檢測到。經(jīng)基因型指導(dǎo)氯吡格雷用藥的試驗組患者發(fā)生支架冠狀動脈血栓事件的比例為0.0%，明顯低于對照組的7.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 基因型指導(dǎo)氯吡格雷用藥有助于患者用藥劑量的調(diào)整，可降低冠狀動脈血栓事件的發(fā)生率。

氯吡格雷； 細胞色素氧化酶P450 2C19； DNA測序

藥物洗脫支架內(nèi)血栓是冠狀動脈支架術(shù)后患者嚴重的并發(fā)癥之一，嚴重者可導(dǎo)致死亡[1]。研究發(fā)現(xiàn)，氯吡格雷抵抗是導(dǎo)致此事件發(fā)生的重要原因之一，而氯吡格雷抵抗和細胞色素氧化酶P450 2C19(CYP2C19)基因變異相關(guān)[2]。CYP2C19代謝表型呈現(xiàn)遺傳多態(tài)性，表現(xiàn)為強代謝型(正常野生型)和弱代謝型，且存在顯著的地區(qū)間和個體間差異[3-4]。在中國人群中最常見的CYP2C19酶代謝缺陷等位基因型主要為CYP2C19*2及CYP2C19*3[5]。由于臨床應(yīng)用氯吡格雷出現(xiàn)的不良事件大多與患者基因多態(tài)性有關(guān)，因此，通過檢測CYP2C19基因型來了解患者氯吡格雷的代謝能力，實現(xiàn)臨床個體化用藥顯得尤為重要。另外，研究不同地區(qū)人群CYP2C19基因多態(tài)性也具有非常重要的臨床意義。本研究根據(jù)CYP2C19基因多態(tài)性位點設(shè)計特異性引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及DNA測序法來鑒定CYP2C19*2、CYP2C19*3在湖北地區(qū)漢族人群中的分布，并觀察基因型指導(dǎo)氯吡格雷用藥的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年11月至2013年11月武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科診斷為急性冠狀動脈綜合征、病情穩(wěn)定并首次接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)(PCI)的當(dāng)?shù)貪h族患者140例為研究對象，平均分為試驗組和對照組各70例。PCI由兩位高年資醫(yī)生協(xié)同完成，手術(shù)過程中完成完全血運重建。所有患者均采用雙聯(lián)抗血小板治療(拜阿司匹林和氯吡格雷)、強化他汀調(diào)脂及其他抗心絞痛輔助治療。兩組患者均排除：(1)消化道潰瘍等出血高危人群；(2)急診PCI患者；(3)PCI過程中出現(xiàn)夾層動脈瘤等嚴重并發(fā)癥的患者；(4)用藥初期出現(xiàn)過敏反應(yīng)而不能堅持服藥的患者。試驗組患者在首次接受PCI術(shù)前采肘靜脈血2～3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝管4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 ABI9700型基因擴增儀、ABI3500測序儀均購自美國Applied Biosystem公司。細胞/血液基因組DNA快速提取試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司。DNA膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)購自美國Axygen公司。所用離心管及槍頭均由美國Axygen公司提供。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 試驗組患者根據(jù)基因型指導(dǎo)氯吡格雷用藥。強代謝型患者PCI術(shù)后氯吡格雷75 mg服用一年。弱代謝型患者PCI術(shù)后氯吡格雷150～225 mg服用一年，或選用其他抗凝血藥物。對照組患者術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后治療與試驗組惟一不同在于不接受基因型檢測，PCI術(shù)后僅經(jīng)驗性給予氯吡格雷75 mg服用一年。

1.3.2 CYP2C19基因多態(tài)性引物設(shè)計 參照Genbank中CYP2C19基因序列，采用Vector NTI 11.0軟件設(shè)計引物。針對CYP2C19*2、CYP2C19*3基因型位點分別設(shè)計1對特異性引物，擴增的PCR產(chǎn)物將包含此特定基因型位點，結(jié)果見表1。

表1 CYP2C19*2、CYP2C19*3擴增引物

1.3.3 外周血基因組DNA提取 參照廠家說明書，采用細胞/血液基因組DNA快速提取試劑盒提取患者外周血基因組DNA后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 DNA測序包含CYP2C19基因多態(tài)性位點的PCR產(chǎn)物 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后，用表1中引物分別對包含CYP2C19基因多態(tài)性位點的DNA片段進行測序并用ABI3500測序儀和Sequencing Analysis 5.2軟件分析擴增產(chǎn)物，以鑒定患者CYP2C19基因型。

1.3.5 PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 用MBI Fermentas 2×PCR mix PCR反應(yīng)液進行PCR擴增，PCR擴增條件：94 ℃ 3 min； 94 ℃ 30 s， 56 ℃ 50 s， 72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；最后 72 ℃ 10 min。PCR結(jié)束后，PCR擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，依據(jù)PCR產(chǎn)物片段大小，初步檢測PCR的特異性。為防止PCR污染，PCR前處理和后處理在不同隔離區(qū)內(nèi)進行,各工作區(qū)均有一定的隔離，操作器材專用。另外，PCR擴增所需試劑均在裝有紫外燈的超凈工作臺配制和分裝。操作時設(shè)陰陽性對照和空白對照，以驗證PCR的可靠性，及協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。

1.3.6 DNA測序包含CYP2C19基因多態(tài)性位點的PCR產(chǎn)物 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后，用表1中引物分別對包含CYP2C19基因多態(tài)性位點的DNA片段進行測序并用ABI3500測序儀和Sequencing Analysis 5.2軟件分析擴增產(chǎn)物，以鑒定患者CYP2C19基因型。

1.3.7 患者隨訪 所有患者PCI術(shù)后一周左右出院，出院后繼續(xù)堅持雙聯(lián)抗血小板、強化他汀調(diào)脂及其他必要的輔助治療。每個月門診隨訪，監(jiān)測患者血常規(guī)、血脂、肝功能、心電圖的變化。若患者有胸痛、胸悶等懷疑心絞痛癥狀，隨時入院檢查。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA測序鑒別CYP2C19基因多態(tài)性結(jié)果 試驗組患者CYP2C19基因型經(jīng)PCR擴增純化后，隨即測序反應(yīng)和序列分析。結(jié)果顯示PCR擴增的70例患者DNA片段的確包含CYP2C19基因多態(tài)性位點。另外，測序結(jié)果可清楚地顯示患者CYP2C19的基因型，結(jié)果見圖1。

2.2 CYP2C19基因多態(tài)性在試驗組中的分布 湖北地區(qū)70例漢族患者中，DNA測序結(jié)果可見CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因型。*1/*1(636GG，681GG)、*1/*2(636GG，681GA)、*2/*2(636GG，681AA)、*1/*3(636GA，681GG)，*3/*3(636AA，681GG)和*2/*3(636GA，681GA)的患者比率分別為33例(47.1%)、29例(41.4%)、4例(5.7%)、4例(5.7%)、0例(0.0%)和0例(0.0%)。

2.3 兩組患者心血管事件發(fā)生率比較 試驗組在8個月的隨訪中，未發(fā)現(xiàn)急性血栓形成相關(guān)事件；2例患者死亡，均與冠心病無關(guān)(車禍、腫瘤)；2例患者分別出現(xiàn)上消化道出血和顱內(nèi)出血，短期停用抗血小板藥物后再次服用。對照組在一年隨訪中共出現(xiàn)5例支架內(nèi)血栓形成的心?；颊撸渲兴劳?例；另有1例出現(xiàn)與支架無關(guān)的心梗，治療后好轉(zhuǎn)。試驗組冠狀動脈血栓事件發(fā)生率(0.0%)明顯低于對照組(7.1%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

注：箭頭所指為多態(tài)性位點；A圖示CYP2C19*2雜合突變；B圖示CYP2C19*2純合突變；C圖示CYP2C19*3雜合突變。

圖1 CYP2C19基因多態(tài)性測序圖

3 討 論

氯吡格雷是目前國際上使用最廣泛的噻吩吡啶類抗血小板藥，用于急性冠狀動脈綜合征、冠狀動脈支架術(shù)和冠心病的預(yù)防，可降低心血管疾病患者心臟病發(fā)作及死亡的風(fēng)險[6]。氯吡格雷本身并不具備抗血小板活性，必須在體內(nèi)通過CYP系統(tǒng)代謝成活性成分，而在眾多相關(guān)酶中，CYP2C19成為人們關(guān)注的焦點[7]。CYP2C19野生型，即CYP2C19*1型的患者對氯吡格雷的代謝功能完好，而CYP2C19*2，*3，*4，*5，*6，*7和*8突變型都是氯吡格雷弱代謝的基因類型[8]，中國人群中以CYP2C19*2和*3型最為常見。因此在應(yīng)用氯吡格雷前，檢測患者的基因多態(tài)性對于其在臨床安全有效應(yīng)用方面有著重要作用。

本研究建立了一個以DNA測序技術(shù)為基礎(chǔ)的可準確有效鑒別患者CYP2C19基因型的臨床檢驗方法。此方法使得臨床大量檢測CYP2C19基因多態(tài)性成為可能，未來可大大提高氯吡格雷的用藥安全和有效性。另外，由于CYP2C19不僅代謝氯吡格雷，同樣也代謝其他藥物，如苯妥英、丙戊酸和奧美拉唑[9-11]，因此通過本方法檢測CYP2C19基因型也可幫助指導(dǎo)這些藥物的使用。

通過分析CYP2C19基因多態(tài)性在試驗組患者中的分布情況發(fā)現(xiàn)，湖北地區(qū)漢族人群中CYP2C19*1、CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因型均存在。CYP2C19*1/*1(強代謝型)、CYP2C19*1/*2(弱代謝型)、CYP2C19*1/*3(弱代謝型)、CYP2C19*2/*2(弱代謝型)、CYP2C19*3/*3(弱代謝型)和CYP2C19*2/*3(弱代謝型)的患者比率分別為33例(47.1%)、29例(41.4%)、4例(5.7%)、4例(5.7%)、0例(0.0%)、0例(0.0%)，分析結(jié)果與其他研究小組關(guān)于中國漢族人群的統(tǒng)計結(jié)果類似[12]。更為重要的是，利用DNA測序法檢測CYP2C19基因型，加大氯吡格雷弱代謝型患者的用藥劑量，或改用其他抗凝血藥物后，試驗組發(fā)生冠狀動脈血栓的概率明顯低于對照組。因此進行CYP2C19基因的突變檢測對于實現(xiàn)氯吡格雷的個性化用藥，降低心血管疾病的病死率具有重要的臨床意義。

雖然本研究已初步顯示基因型檢測對指導(dǎo)氯吡格雷用藥具有重要的臨床價值，但不足之處在于樣本量相對較少，尚需進一步擴大樣本加以驗證。

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Clinical value of DNA sequencing for CYP2C19 polymorphisms detection on the application of clopidogrel*

WUWei1，2，HANRui-Ling1，2，WANGLi-yue3,LIYan1，2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory，2.MolecularDiagnosticCenter，People′sHospitalofWuhanUniversity，Hubei，Wuhan430060,China;3.DepartmentofCardiovascularMedicine,PurenHospitalofWuhan,WuhanHebei430081,China)

Objective To evaluate the clinical application value of detectiing Cytochrome P450 2C19 (CYP2C19) polymorphisms by DNA sequencing in clopidogrel application.Methods From November 2010 to November 2013,a total of 140 blood samples were randomly collected in patients with acute coronary syndrome and treated with percutaneous coronary intervention (PCI) for the first time in the department of cardiology in People′s Hospital of Wuhan University.Aaa the patients were divided as control group and study group randomly,70 patients in each group.According to known gene sequences of CYP2C19,specific primers were synthesized to genotype the CYP2C19*2 and CYP2C19*3 alleles through polymerase chain reaction (PCR) amplification and DNA sequencing.Meanwhile,the distribution of these alleles in the study group was analyzed.The control group didn′t do genotype but use clopidogrel.The incidence rates of coronary artery thrombosis in the process of follow-up between the two groups was compared.Results DNA sequencing results showed that 4 kinds of gene type were detected including *1/*1(636GG,681GG),*1/*2(636GG,681GA),*2/*2(636GG,681AA) and *1/*3(636GA,681GG).The distribution rates of them were 47.1%,41.4%,5.7% and 5.7% respectively.However,*3/*3(636AA,681GG) and *2/*3(636GA,681GA) were not found.Besides,the incidence rate of coronary artery thrombosis in the study group(0.0%) was significant lower than that of the control group (7.1%)(P<0.05).Conclusion It is help to use the detection of CYP2C19 polymorphism by DNA sequencing guiding the dosage of clopidogrel,and could reduce the occurrence of coronary artery thrombosis.

clopidogrel； cytochrome P450 2C19； DNA sequencing

國家自然科學(xué)基金資助項目(81200389)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金資助項目(20120141120077)；教育部中央高校基本科研業(yè)務(wù)專項基金資助項目(121069)；湖北省自然基金資助項目(2010CDB8701)。

吳薇，女，博士，主管技師，主要從事臨床分子診斷研究?！?/p>

,E-mail：yanlitf@yahoo.com.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.001

A

1672-9455(2015)04-0433-03

2014-07-30

2014-09-28)