結(jié)合雌激素對(duì)去勢(shì)大鼠骨折愈合生物力學(xué)指標(biāo)的影響

陳鏝如，徐克惠，喬 林

(1.四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610041)

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·論 著·

結(jié)合雌激素對(duì)去勢(shì)大鼠骨折愈合生物力學(xué)指標(biāo)的影響

陳鏝如1，徐克惠2，喬 林2

(1.四川省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610072；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610041)

目的 探討結(jié)合雌激素(倍美力)對(duì)去勢(shì)大鼠骨折愈合及骨痂生物力學(xué)指標(biāo)的影響。方法 采用54只6月齡雌性大鼠，分為倍美力組、偽手術(shù)組和去勢(shì)組。倍美力組和去勢(shì)組大鼠均切除兩側(cè)卵巢，切除后第8周，各組大鼠均實(shí)施右側(cè)股骨骨折，同時(shí)倍美力組按0.065 mg/(kg·d)給予倍美力藥物灌胃。3組均在實(shí)施骨折后第2、4、6、8周隨機(jī)處死大鼠，取其右側(cè)股骨行X射線照片觀察骨痂變化，測定軟骨痂及骨折斷端骨痂吸光度、骨痂Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分吸光度及骨折后第8周右股骨的生物力學(xué)指標(biāo)。結(jié)果 X線片顯示，倍美力組和偽手術(shù)組骨痂密度在骨折后各時(shí)期均高于去勢(shì)組；倍美力組在骨折后第8周的軟骨痂吸光度和骨折斷端骨痂吸光度均低于去勢(shì)組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與偽手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；去勢(shì)組的骨痂Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分在骨折后各時(shí)期均低于倍美力組與偽手術(shù)組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而倍美力組與偽手術(shù)組的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；倍美力組的破壞強(qiáng)度、彎曲彈性模量、剛度系數(shù)均優(yōu)于去勢(shì)組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與偽手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 結(jié)合雌激素可使骨痂中Ⅰ型膠原合成增多，使骨的柔韌性增加、硬度增加，最終改善骨的生物力學(xué)性能。

結(jié)合雌激素； 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折； 生物力學(xué)； 大鼠

絕經(jīng)后雌激素下降對(duì)骨修復(fù)重建的影響受到了廣泛的關(guān)注，有報(bào)道顯示雌激素對(duì)骨折愈合有著重要的調(diào)節(jié)作用[1-2]。而骨折愈合后的生物力學(xué)特性是反映骨生長代謝的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過切除大鼠兩側(cè)卵巢模擬婦女絕經(jīng)狀態(tài)，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折的動(dòng)物模型，探討結(jié)合雌激素在骨質(zhì)疏松性骨折愈合中對(duì)骨痂生物力學(xué)指標(biāo)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 54只體質(zhì)量為280～380 g的6月齡雌性大鼠，隨機(jī)分為倍美力組、偽手術(shù)組、去勢(shì)組，每組各18只。喂食顆粒飼料，動(dòng)物房定期消毒和通風(fēng)，12 h間隔照明，室溫控制于19～22 ℃。

1.2 建立骨質(zhì)疏松性骨折動(dòng)物模型 大鼠予以氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔注射麻醉成功后，兩側(cè)腰背部切口進(jìn)入腹腔。偽手術(shù)組僅切除少許脂肪組織，倍美力組與去勢(shì)組則切除兩側(cè)卵巢。將所有切除的卵巢組織制成石蠟切片，顯微鏡觀察證實(shí)切除組織為卵巢。去勢(shì)后8周進(jìn)行陰道細(xì)胞學(xué)檢查。實(shí)施手術(shù)后8周，3組大鼠均暴露右側(cè)股骨中段，在氯胺酮(0.1 g/kg)麻醉下橫行切斷，然后克氏針?biāo)枨荒嫘袃?nèi)固定，術(shù)后自由活動(dòng)和進(jìn)食。骨折后第2天開始給予灌胃，每日1次，連續(xù)8周。去勢(shì)組及偽手術(shù)組均給予1.5 mL生理鹽水灌胃，倍美力組給予0.065 mg/(kg·d)倍美力灌胃。

1.3 方法

1.3.1 X線觀察 實(shí)施骨折后第2、4、6、8周，每組隨機(jī)處死4只大鼠，取右側(cè)股骨全長行X射線照片，觀察骨痂變化。

1.3.2 骨痂吸光度測定 使用MDX-3A黑白密度計(jì)測定右側(cè)股骨軟骨痂吸光度，以骨折線長為直徑，取離骨折線1/2直徑距離的四點(diǎn)照射；測定骨折斷端骨痂吸光度，取離骨折端0.5個(gè)骨橫徑照射。

1.3.3 骨痂Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分吸光度測定 骨折模型建立后第2、4、6、8周，每組隨機(jī)處死4只大鼠，取右側(cè)股骨中段的骨痂組織，制備成石蠟切片。免疫組化檢測采用I型膠原SABC試劑盒(武漢博士德公司)，按說明書中的標(biāo)準(zhǔn)步驟操作。觀察Ⅰ型膠原的表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或深棕黃色者為陽性。每張切片隨機(jī)選取10×40倍下5個(gè)不重疊視野，用Image-Pro Plus4.01的圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽性染色的強(qiáng)度進(jìn)行半定量測定，記數(shù)Ⅰ型膠原陽性表達(dá)的積分吸光度。積分吸光度是平均吸光度與面積的乘積，可以反映蛋白表達(dá)量。

1.3.4 生物力學(xué)指標(biāo)測定 取實(shí)施骨折后8周的大鼠右側(cè)骨折股骨，拔出固定針后予以生理鹽水紗布包裹，放入-20 ℃的冰柜保存?zhèn)溆?。次日使用電子萬能實(shí)驗(yàn)機(jī)、高精度數(shù)字位移計(jì)、10 kg力傳感器、X-Y函數(shù)記錄儀對(duì)骨折股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)。加載速度2 mm/min，支座間距24 mm。測定剛度系數(shù)、破壞強(qiáng)度、破壞橈度、彈性模量、破壞能量吸收5項(xiàng)生物力學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié) 果

2.1 一般結(jié)果 倍美力組和去勢(shì)組所切除的組織經(jīng)病理切片證實(shí)為卵巢組織。切除卵巢后8周陰道細(xì)胞學(xué)觀察，倍美力組和去勢(shì)組顯示：上皮細(xì)胞幾乎無表層細(xì)胞，以底層細(xì)胞為主，呈雌激素缺乏狀態(tài)；偽手術(shù)組顯示：雌激素水平先升高后下降，呈周期性改變。54只大鼠除5只死亡，其余49只大鼠均完成實(shí)驗(yàn)。各組大鼠在實(shí)施骨折手術(shù)前、后體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，骨折部位均在股骨中分，顯示各組大鼠除藥物因素外其余條件均相同，具有可比性。

2.2 X線片觀察 去勢(shì)組骨痂密度在骨折后各時(shí)期均低于倍美力組和偽手術(shù)組，8周時(shí)去勢(shì)組骨折線仍較清晰，偽手術(shù)組和倍美力組骨折線模糊、甚至消失。見圖1。

2.3 骨痂吸光度

2.3.1 各組大鼠骨折后不同時(shí)期軟骨痂吸光度比較 骨折后第8周，去勢(shì)組軟骨痂吸光度高于倍美力組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；倍美力組與偽手術(shù)組軟骨痂吸光度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；倍美力組軟骨痂吸光度隨骨折時(shí)間的增加而降低。見表1。

注：A為去勢(shì)組；B為偽手術(shù)組；C為倍美力組。

圖1 實(shí)施骨折后第2周和第8周各組大鼠骨折X線片表1 各組大鼠骨折后不同時(shí)期軟骨痂吸光度比較±s，A)

注：與去勢(shì)組比較，aP<0.05；與偽手術(shù)組比較，bP<0.05。

2.3.2 各組大鼠骨折后不同時(shí)期骨折斷端骨痂吸光度比較 各組的骨折斷端骨痂吸光度均隨骨折時(shí)間增加而降低。骨折后各時(shí)期，去勢(shì)組的骨折斷端骨痂吸光度均高于倍美力組和偽手術(shù)組，且骨折后第6、8周組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨折后各時(shí)期，倍美力組與偽手術(shù)組骨折斷端骨痂吸光度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠骨折后不同時(shí)期骨折斷端骨痂 的吸光度

注：與去勢(shì)組比較，aP<0.05。

表3 各組大鼠骨折后各時(shí)期骨痂Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分 吸光度比較

注：與去勢(shì)組比較，aP<0.05。

注：A為Ⅰ型膠原在軟骨細(xì)胞胞漿表達(dá)(×400)；B為Ⅰ型膠原在骨小梁表達(dá)(×100)；C為去勢(shì)組骨折后第2～8周Ⅰ型膠原表達(dá)(×100)；D為倍美力組骨折后第8周Ⅰ型膠原表達(dá)(×100)；E為倍美力組骨折后第4周Ⅰ型膠原表達(dá)(×100)；F為倍美力組骨折后第6、8周Ⅰ型膠原表達(dá)(×100)。

圖2 I型膠原在骨組織的表達(dá)

2.4 各組大鼠骨折后各時(shí)期骨痂Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分吸光度比較 骨折后各時(shí)期，去勢(shì)組Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分吸光度均低于倍美力組與偽手術(shù)組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；倍美力組與偽手術(shù)組各時(shí)期Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分吸光度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。Ⅰ型膠原在骨組織的表達(dá)，見圖2。由圖2C可見，去勢(shì)組骨折后第2～8周 Ⅰ型膠原均主要在軟骨細(xì)胞表達(dá)；由圖2D可見倍美力組骨折后第8周，Ⅰ型膠原在軟骨細(xì)胞表達(dá)較少，與偽手術(shù)組相似；由圖2E可見，倍美力組骨折后第4周，Ⅰ型膠原主要在成骨細(xì)胞表達(dá)，軟骨細(xì)胞也有少量表達(dá)，與偽手術(shù)組相似；由圖2F可見，倍美力組骨折后第6、8周，Ⅰ型膠原主要在骨痂周邊組織、骨小梁中表達(dá)，與偽手術(shù)組相似。

2.5 各組大鼠骨折后8周各項(xiàng)股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較 倍美力組的破壞強(qiáng)度、彎曲彈性模量、剛度系數(shù)均優(yōu)于去勢(shì)組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。倍美力組和偽手術(shù)組間各項(xiàng)指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠骨折后8周各項(xiàng)股骨生物力學(xué)指標(biāo)比較±s)

注：與去勢(shì)組比較，aP<0.05。

3 討 論

因絕經(jīng)后婦女骨丟失與大鼠切除卵巢后的骨丟失相似，大鼠模型目前已成為研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的成熟模型[3-4]。本研究倍美力組和去勢(shì)組大鼠均切除兩側(cè)卵巢，陰道細(xì)胞學(xué)觀察，呈雌激素缺乏狀態(tài)，模擬絕經(jīng)，成功建立了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。

骨折愈合是特殊的組織修復(fù)，骨痂組織出現(xiàn)不同功能細(xì)胞活動(dòng)，并有大量膠原纖維產(chǎn)生，其間有大量鈣鹽沉積。膠原纖維是組成骨結(jié)構(gòu)和維持骨強(qiáng)度的基質(zhì)蛋白。Ⅰ型膠原是骨有機(jī)質(zhì)的重要成分，在骨基質(zhì)礦化、骨質(zhì)吸收與形成、骨分化與增殖等過程中起重要作用，其含量與骨的生物學(xué)特性密切相關(guān)[5]。本實(shí)驗(yàn)中，去勢(shì)組骨痂Ⅰ型膠原陽性表達(dá)積分吸光度在骨折后各時(shí)期均較倍美力組和偽手術(shù)組低，提示Ⅰ型膠原在去勢(shì)組合成較倍美力組和偽手術(shù)組少。膠原纖維在骨折愈合中不僅是結(jié)締組織修復(fù)愈合的重要因素，更是鈣鹽沉積不可缺少的基礎(chǔ)。骨折端的骨痂密度能說明骨痂的鈣化程度。而骨痂吸光度可反映骨痂密度，骨痂吸光度越大，骨痂密度越小。本研究顯示，骨折后第8周，去勢(shì)組的軟骨痂密度低于倍美力組(P<0.05)，而骨折后各時(shí)期，去勢(shì)組骨折斷端骨痂密度均低于倍美力組和偽手術(shù)組，且骨折后第6、8周組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這說明去勢(shì)組骨折斷端骨痂鈣鹽沉積少，骨礦化差。由此可見大鼠去勢(shì)后雌激素水平低下，Ⅰ型膠原合成少，骨礦化差。提示雌激素降低可能影響Ⅰ型膠原的表達(dá)，從而影響Ⅰ型膠原的形成和結(jié)構(gòu)，為骨礦化提供框架的機(jī)械支持能力降低，使無機(jī)質(zhì)無法沉淀礦化，骨鹽失去依附，導(dǎo)致去勢(shì)組骨折端骨量的丟失，骨折斷端骨痂密度降低。

骨折愈合的生物力學(xué)特性反映骨的生長代謝，它是骨結(jié)構(gòu)連續(xù)性、骨量、骨材料特性等的綜合反映。骨的生物力學(xué)性能不僅是反映骨質(zhì)量的重要指標(biāo)[6-7]，也是評(píng)價(jià)骨質(zhì)疏松藥物療效的指標(biāo)之一[8-9]。彈性模量表示材料抗形變的能力，反映骨自身的強(qiáng)度和韌性。剛度系數(shù)反映骨抵抗外力發(fā)生形變的能力，破壞能量吸收顯示導(dǎo)致骨折所需能量，以上指標(biāo)均反映骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)性能[10]。破壞強(qiáng)度反映骨的塑形能力，而骨塑形主要由有機(jī)質(zhì)決定。本研究結(jié)果顯示，骨折后第8周去勢(shì)組生物力學(xué)性能中的彎曲彈性模量、剛度系數(shù)、破壞強(qiáng)度均低于倍美力組和偽手術(shù)組。Ⅰ型膠原的表達(dá)減少，使骨折斷端骨痂密度降低，造成骨小梁材料力學(xué)性能和結(jié)構(gòu)力學(xué)性能的變化，從而可能導(dǎo)致骨抵抗外力的能力降低，骨脆性增加，骨折愈合質(zhì)量降低。而骨Ⅰ型膠原對(duì)骨組織保持足夠的彈性剛度和彎曲度應(yīng)力是必需的。倍美力的雌激素作用可能促進(jìn)骨折愈合過程中Ⅰ型膠原增加，從而使骨的柔韌性增加，同時(shí)緩慢增加骨量，加快骨礦化，使骨的硬度也有所增加，最終改善骨的生物力學(xué)性能。

綜上所述，結(jié)合雌激素干預(yù)骨質(zhì)疏松性大鼠可有效改善骨的生物力學(xué)性能，促進(jìn)骨折愈合，但其臨床應(yīng)用的劑量、時(shí)間及效果仍有待進(jìn)一步的臨床實(shí)踐。

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Effects of premarin on bone biomechanic indexes in fracture healing of ovariectomized rats

CHENMan-ru1,XUKe-hui2,QIAOLin2

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China;2.DepartmentofObstetricsandGynecology,WestChinaSecondHospital,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To explore the effects of conjugated estrogen hormones (premarin) on the bone biomechanic indexes and fracture healing of the ovariectomized rats.Methods 54 female rats，aged 6-month-old,were divided into 3 groups:premarin group,sham operation group(SHAM group) and ovariectomized group(OVX group).Rats in the premarin group and the OVX group were ovariectomized.The right femur was broken by operation at 8 weeks after ovarrectomization.Premarin [0.065 mg/(kg·d)] was given immediately through intragastric administration after establishment of osteporotic fracture model in the premarin group.Rats in the 3 groups were randomly killed at the end of postoperative 2,4,6,8 weeks respectively.The right femur was examined for observing the change of bone callus by X-rays;the absorbance determination of cartilage callus and bone callus in the end of femural fracture were performed;the integral absorbance detection of positive expression of type Ⅰ bone collagen and the detection of biomechanical indexes of right femur at 8 weeks after fracture were performed.Results The X-ray examination showed that the bone callus density in various periods after fracture in the premarin group and the SHAM group were significantly higher than that in the OVX group.The absorbance of cartilage callus and bone callus of the end of fracture at 8 weeks after fracture in the premarin group were lower than that in the OVX group with statistical difference(P<0.05),but without statistical differences compared with that in the SHAM group(P>0.05).The integral absorbance of positive expression of type Ⅰ bone collagen in vanous periods in the OVX group was significantly lower than that in the premarin group and the SHAM group(P<0.05),while there were no statistical differences in the expression between the premarin group and the SHAM group(P>0.05).The destructive intension,elastic modulus and stiffness coefficient of right femur in the premarin group were better than those in the OVX group with statistical differences(P<0.05),while without statistical differences compared with the SHAM group(P>0.05).Conclusion Premarin may increase the synthesis of type Ⅰ collagen,and the flexibility and hardness of bones,finally improve the biomechanics properties.

conjugated estrogen hormones(premarin)； postmenopausal osteoporotic fracture； biomechanics； rat

陳鏝如，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事生殖內(nèi)分泌研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.017

A

1672-9455(2015)05-0622-03

2014-10-16

2014-12-10)