血漿miR-324-5p對單純性先天性心臟病預后風險分級的評估

萬 楠，王 璐，孟冬婭，鄭 偉，胡曉芳

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，沈陽 110016)

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·論 著·

血漿miR-324-5p對單純性先天性心臟病預后風險分級的評估

萬 楠，王 璐，孟冬婭，鄭 偉，胡曉芳△

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，沈陽 110016)

目的 研究單純性先天性心臟病(CHD)患者血漿miR-324-5p表達變化，評價其在CHD預后和風險分級等方面的臨床應用價值。方法 選取2012年1月至2013年1月沈陽軍區(qū)總醫(yī)院先天性心臟病內(nèi)科收治的CHD患兒76例為CHD組，另選取13例健康者血清標本為對照組，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測血漿中miR-324-5p的表達變化，通過Kalpan-Meier生存分析、Cox比例風險模型等綜合評價血漿miR-324-5p在CHD預后和風險分級等方面的臨床應用價值。結果 與對照組相比，單純性CHD患者外周血漿miR-324-5p表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Kaplan-Meier生存分析表明，miR-324-5p表達水平較高組患者復發(fā)風險及死亡概率更高(P<0.05)；Cox比例風險模型分析表明，在單因素分析中，miR-324-5p表達水平和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)是CHD的發(fā)病危險因子(P<0.05)，風險比(HR)分別為1.79和2.17；在多因素分析中，只有BMI是CHD的發(fā)病危險因子(P<0.05)，HR為1.38，HR 95%置信區(qū)間(CI)為(1.12，1.79)。結論 血漿miR-324-5p作為CHD診斷的生物學標志物具有一定的臨床應用價值，但還需要與其他指標聯(lián)合應用。

先天性心臟?。?miR-324-5p； 預后

先天性心臟病(CHD)是一種常見的先天畸形，據(jù)相關文獻報道其在新生兒中的發(fā)病率為1.25%[1]。盡管目前相關檢測和治療手段已經(jīng)提高，但是CHD引起的死亡仍占新生兒死亡的3%，占先天畸形死亡的46%[2]。目前對CHD的治療以手術為主，這不僅給患兒及其家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔，且近50%的患兒面臨著再次手術、心律失常及心力衰竭等問題[3-6]。因此，對CHD患者的預后判斷和風險分級尤為重要，盡早地對高風險患者進行相關治療，對提高患者的生存率和生活質(zhì)量有著重要意義。miR-324-5p位于17染色體短臂1區(qū)3帶1亞帶(17p13.1)，編碼于酰基輔酶A脫氫酶第35個內(nèi)含子并與其共轉(zhuǎn)錄。以往關于miR-324-5p的研究多集中于腫瘤，近期的研究指出循環(huán)系統(tǒng)miR-324-5p可用于診斷心力衰竭，提示miR-324-5p與心血管系統(tǒng)密切相關。因此，本研究通過檢測外周血清miR-324-5p來闡明CHD的疾病發(fā)生、發(fā)展機制，并為治療及預后提供有價值的信息。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2013年1月本院先天性心臟病內(nèi)科收治的76例單純性CHD患者為CHD組；另選取本科健康者13例為對照組，所有單純性CHD患者均具有典型的臨床表現(xiàn)，且經(jīng)心臟超聲和手術確診。

1.2 方法 所有患者于入院前抽取靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，3 000 r/min離心15 min，分離血漿于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1 血漿微RNA(miRNA)的提取 采用天根生化(北京)科技有限公司RNAprep pure Tissue Kit試劑盒(批號DP121221)進行血漿miRNAs提取，提取的miRNAs于-70 ℃保存以防止降解。

1.2.2 miR-324-5p反轉(zhuǎn)錄 采用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄方法進行miR-324-5p反轉(zhuǎn)錄。莖環(huán)實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)引物：5′-CTC AAC TGG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TCA GTT GAG ACA CCA AT-3′；反應條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。應用TaKaRa Real-Time PCR試劑盒，以U6為內(nèi)參照基因進行實時熒光定量PCR分析，正向引物：5′-ACA CTC CAG CTG GGC GCA TCC CCT AGG GC-3′；反向引物：5′-TGG TGT CGT GGA GTC G-3′；內(nèi)參基因U6-sense：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；U6-antisense：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′。實時熒光定量PCR反應在ABI Prism 7500型高通量熒光定量儀(美國ABI公司)上進行，反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，95 ℃ 5 s。反應結果采用標準曲線法進行分析，每個樣品重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測血清中miR-324-5p的表達水平 與對照組相比，CHD患者外周血漿miR-324-5p表達水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為兩組血漿miR-324-5p相對表達水平，與CHD組比較，aP<0.05；B為實時熒光定量PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。

圖1 CHD患兒與對照組血漿miR-324-5p 表達情況

2.2 Kalpan-Meier生存分析 以miR-324-5p表達水平的中位數(shù)0.157為標準將CHD患者分為高表達組與低表達組。在1年的隨訪中，由于各種原因造成失訪的患者11例，其余CHD患者中發(fā)生死亡3例，肺動脈高壓4例，心律失常8例，心力衰竭4例，肺炎2例。對數(shù)秩檢驗分析結果表明，miR-324-5p表達水平較高的患者將承受更多的發(fā)病風險及較高的死亡概率(χ2=4.456，P=0.035)。

2.3 CHD發(fā)病風險分析 CHD組與對照組的患兒年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血紅蛋白與血小板水平及miR-324-5p表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。將以上因素代入Cox比例風險模型進行分析，單因素分析發(fā)現(xiàn)，miR-324-5p表達水平和BMI都是CHD的發(fā)病危險因子，風險比(HR)分別為1.79(P=0.046)和2.17(P<0.01)；但在多因素分析中，只有BMI是CHD的發(fā)病危險因子(P=0.021)，HR為1.38，HR 95%置信區(qū)間(CI)為(1.12，1.79)。見表2。

表1 兩組基本資料比較或n(%)]

注：amiR-324-5p表達水平用2-ΔCt中位數(shù)表示，2-ΔCt=2-(Ct miR-324-5p- CtU6)。

表2 CHD發(fā)病危險因素的Cox比例風險模型單因素分析

注：amiR-324-5p表達水平用2-ΔCt中位數(shù)表示，2-ΔCt=2-(Ct miR-324-5p- CtU6)。

3 討 論

miRNAs是一類內(nèi)源性的、非編碼的小分子(18～24個核苷酸)RNA，通過與靶基因3 -UTR互補結合，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控靶基因表達。miRNAs的表達具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，在心臟發(fā)育、骨骼肌增殖分化和腫瘤疾病中都起著重要的作用[7-9]。細胞內(nèi)miRNAs水平異常表達已被證實與許多心血管疾病，如心力衰竭、心肌肥大及心血管重塑等密切相關。一些miRNAs在心血管組織中高表達，它們在調(diào)控心血管的發(fā)育和疾病方面具有重要意義，這給CHD的診斷和治療帶來了希望[10-12]。早期的miRNAs研究主要集中于組織或細胞，在臨床上無法用于CHD的診斷。近幾年的研究表明，人外周血清中也存在豐富的miRNAs，并且十分穩(wěn)定，能抵抗RNA酶降解，并可以抵御酸、堿和高溫等不良環(huán)境，室溫放置一周仍穩(wěn)定。這使得血清miRNAs具備了常規(guī)檢測指標的基本條件。同時在疾病狀態(tài)下，血液循環(huán)中的miRNAs主要來自患病的組織細胞的主動分泌，并通過外泌體、微小體等載體傳送到微循環(huán)中的免疫細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞或其他的受體細胞中，進而影響這些受體細胞的功能。

以往研究miR-324-5p多集中于腫瘤，而Ellis等[13]提出循環(huán)系統(tǒng)miR-324-5p可用于診斷心力衰竭，提示其與心血管系統(tǒng)密切相關。本研究首先通過實時熒光定量PCR方法初步分析循環(huán)系統(tǒng)miR-324-5p在疾病人群中的表達分布狀況，結果表明CHD患者血清miR-324-5p表達水平較對照組明顯增高。隨后Kaplan-Meier生存分析表明，miR-324-5p高表達患者的預后較低表達患者差，將承受更多的發(fā)病風險及較高的死亡概率。進一步采用Cox比例風險模型分析CHD的發(fā)病危險因素，在單因素分析中發(fā)現(xiàn)miR-324-5p表達水平和BMI都是CHD的發(fā)病危險因子，HR分別為1.79和2.17；但在多因素分析中，只有BMI是CHD的發(fā)病危險因子，HR為1.38。說明miR-324-5p在CHD的發(fā)病機制上并不是一個主要因素，可能處于一個旁路通道中，這也同時說明CHD的發(fā)病是多種因素綜合作用的結果，miR-324-5p并未起到?jīng)Q定性作用。另一方面，miR-324-5p通過調(diào)控細胞多種生物學表現(xiàn)，導致下游基因和細胞生物學性狀的一系列變化。作者認為在胚胎心臟發(fā)育過程中miR-324-5p通過直接或間接抑制某些基因表達來調(diào)節(jié)心肌細胞的凋亡和增殖，當miR-324-5p的表達失調(diào)，影響某個或某些靶基因表達水平并發(fā)生失控，繼而引起心臟形態(tài)和功能的異常，導致CHD發(fā)生。

綜上所述，在多因素分析中miR-324-5p雖然不是CHD的發(fā)病危險因子，但是miR-324-5p高表達的CHD患者卻有較高的死亡概率和發(fā)病風險，提示可以將它作為臨床預后判斷的輔助指標，對提高CHD患者的生存質(zhì)量有著一定的指導意義。

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Plasma miR-324-5p for evaluation of prognostic risk classification in patients with simple congenital heart disease

WANNan，WANGLu，MENGDong-ya，ZHENGWei，HUXiao-fang△

(DepartmentofClinicalLaboratory,GeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang,Liaoning110016,China)

Objective To investigate the change of plasma miR-324-5p expression in the patients with simple congenital heart disease(CHD) and to evaluate its clinical application value in the prognosis and the risk classification of CHD.Methods 76 children patients with CHD and 13 healthy controls were detected the plasma expression levels of miR-324-5p by the real-time PCR.The clinical application value of plasma miR-324-5p in the prognosis and the risk classification of CHD was comprehensively evaluated by adopting the Kalpan-Meier survival analysis,Cox proportional hazard model.Results The peripheral plasma miR-324-5p expression level in the simple CHD group was increased compared with the control group,the difference had statistical significance (P<0.05);the Kalpan-Meier survival analysis indicated that the higher miR-324-5p expression group had much higher recurrent risk and much higher death probability(P<0.05);the Cox proportional hazard model indicated that in the univariate analysis,miR-324-5p and BMI were the risk factors of CHD(P<0.05).The hazard ratio (HR) was 1.79 and 2.17 respectively.The multivariate analysis demonstrated that only BMI was the risk factor of CHD(P<0.05),HR was 1.38,95%CI(1.12，1.79).Conclusion Plasma miR-324-5p as a biomarker of CHD diagnosis could have certain clinical application value,but should be combined application with other indicators.

congenital heart disease; miR-324-5p; prognosis

萬楠，男，碩士，副主任技師，主要從事心血管疾病風險研究?！?/p>

，E-mail：syplay@me.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.010

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1672-9455(2015)05-0603-03

2014-10-26

2014-12-10)