腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血樹突狀細(xì)胞亞群變化及意義*

謝明祥，王 偉，劉后銀(．遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州遵義 5600；．四川省眉山市仁壽縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科 60500；．蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽蚌埠 000)

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腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血樹突狀細(xì)胞亞群變化及意義*

謝明祥1，王 偉2，劉后銀3(1．遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，貴州遵義 563003；2．四川省眉山市仁壽縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科 620500；3．蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，安徽蚌埠 233000)

目的 應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血樹突狀細(xì)胞(DC)亞群變化進(jìn)行分析，探討其數(shù)量、變化規(guī)律及不同惡性程度膠質(zhì)瘤患者免疫功能的差異。方法 檢測(cè)試驗(yàn)組及對(duì)照組DC1、DC2，抽取外周血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血DC1、DC2。結(jié)果 外周血流式細(xì)胞儀結(jié)果分析，兩組DC1/PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)、DC2/PBMC比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。膠質(zhì)瘤患者術(shù)后早期外周血DC1/PBMC、DC2/PBMC百分比與術(shù)前比較有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后晚期外周血DC1/PBMC的百分比高于術(shù)后早期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。惡性程度高的膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期DC1/PBMC、DC2/PBMC低于惡性程度低的膠質(zhì)瘤患者。結(jié)論 腦膠質(zhì)瘤患者與健康人比較，外周血中DC1/PBMC、DC2/PBMC比例下降，表明腦膠質(zhì)瘤患者較健康人免疫功能降低；膠質(zhì)瘤患者外周血DC亞群數(shù)量與膠質(zhì)瘤惡性程度呈負(fù)相關(guān)。

腦膠質(zhì)瘤； 外周血； 樹突狀細(xì)胞亞群； 圍手術(shù)期

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，雖然免疫治療取得一定進(jìn)展，但療效不確切。樹突狀細(xì)胞(DC)是體內(nèi)重要的抗原遞呈細(xì)胞，能對(duì)腫瘤加以識(shí)別及對(duì)抗，在外周血中含量為白細(xì)胞總數(shù)的1%。膠質(zhì)瘤能分泌多種免疫抑制因子和免疫逃逸因子，使宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤抗原無法加以識(shí)別，有研究發(fā)現(xiàn)，DC能夠高表達(dá)MHC-Ⅰ和MCH-Ⅱ類分子、共刺激分子和黏附分子，從而克服腫瘤細(xì)胞免疫原性弱及共刺激分子和黏附分子表達(dá)的缺陷。外科手術(shù)可以最大限度地減少膠質(zhì)瘤的體積，降低膠質(zhì)瘤分泌的多種免疫抑制因子和免疫逃逸因子的量，改善膠質(zhì)瘤患者免疫功能。本課題應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)，研究膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血DC亞群變化與手術(shù)治療及惡性程度的關(guān)系，為腦膠質(zhì)瘤免疫治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 試驗(yàn)耗材包括：一般固定液、棉簽、紗布、醫(yī)用消毒液、醫(yī)用石蠟、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管、75%醫(yī)用乙醇等。實(shí)驗(yàn)試劑包括：CD123-PE、CD11C-PE、anti-HLA-DR-PECy5(美國(guó)BD公司)；洗液：磷酸鹽緩沖液pH7.43；固定液：1%多聚甲醛(實(shí)驗(yàn)室自配)；堿性粒細(xì)胞、白細(xì)胞溶解液STROMATOLYSER-FB、白細(xì)胞溶解液STROMATOLYSER-4DL、白細(xì)胞染液 STROMATOLYSER-4DS、清洗液CELLCLEAN(日本Sysmex公司)。主要試劑配制：PBS緩沖液、1%多聚甲醛。主要實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備：BD-FACB Calibu流式細(xì)胞分析儀、振蕩混勻器、離心機(jī)、石蠟切片機(jī)、普通顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 分組 試驗(yàn)組患者15例：住院行腫瘤切除術(shù)，術(shù)后病理學(xué)檢查確定為腦膠質(zhì)瘤患者，術(shù)前(1 d)及術(shù)后(1、3、5、7 d)外周血DC1、DC2細(xì)胞百分比。對(duì)照組：無相關(guān)腫瘤、無免疫性疾病史及無各種過敏史的健康人群組15例，同法進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 有免疫系統(tǒng)疾病或感染性疾??；60 d內(nèi)接受放、化療或使用影響免疫功能的藥物；合并腫瘤并發(fā)癥(腫瘤卒中、腦疝等)，手術(shù)中輸血均不納入研究對(duì)象。所有入組患者均知情同意。

1.2.3 外周血流式細(xì)胞術(shù)檢查 試驗(yàn)組與對(duì)照組血樣均采用EDTA抗凝管采集2 mL并暫時(shí)保存于4 ℃冰箱，采集后的新鮮血樣于24 h之內(nèi)送至本院細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血液中的DC1、DC2，并收集原始數(shù)據(jù)。

1.2.4 腫瘤患者手術(shù)切除腫瘤組織的病理檢查 手術(shù)中切除的新鮮腫瘤組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，每個(gè)蠟塊按照20～40 μm的間隔連續(xù)切片，切片厚度4 μm；然后從不同代表平面的10張切片中選取2張進(jìn)行常規(guī)病理HE染色，由病理科協(xié)助完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 健康人群及腦膠質(zhì)瘤患者組外周血DC1和DC2檢測(cè)結(jié)果 見表1、圖1。

表1 健康人群及腦膠質(zhì)瘤患者組外周血DC1和DC2的檢測(cè)結(jié)果

圖1 健康人群與腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)前、術(shù)后早期、術(shù)后晚期DC1/PBMC、DC2/PBMC比較

2.2 不同惡性程度腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血DC1和DC2檢測(cè)結(jié)果 見表2、圖2。

表2 不同惡性程度腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期外周血DC1和DC2檢測(cè)結(jié)果

圖2 不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤患者圍手術(shù)期6次外周血流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC1/PBMC、DC2/PBMC比較(%)

3 討 論

研究表明，腦腫瘤患者的免疫功能與其他腫瘤患者一樣，有所降低。在手術(shù)切除腫瘤后，降低的免疫功能則逐漸恢復(fù)，而當(dāng)腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)，患者的免疫水平又可再次降低。因此，了解腦腫瘤患者的免疫功能狀態(tài)，對(duì)其病情判斷和預(yù)后有重要意義。而外周血DC的數(shù)值和性狀常反映出生理和病理狀況下DC在免疫應(yīng)答中的地位，進(jìn)而反饋出機(jī)體的免疫狀況[1]。

結(jié)果顯示，(1)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)前外周血DC1、DC2占單個(gè)核細(xì)胞的百分含量均明顯低于健康者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。DC1、DC2百分含量的下降表明腦膠質(zhì)瘤患者機(jī)體的抗原遞呈細(xì)胞減少，激活T淋巴細(xì)胞的能力降低，提示腦膠質(zhì)瘤存在保護(hù)性免疫反應(yīng)減弱，機(jī)體免疫功能降低。(2)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1～3 d外周血DC1、DC2占單個(gè)核細(xì)胞的百分比明顯低于術(shù)前及健康者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明腦膠質(zhì)瘤患者免疫功能的降低一方面可能是手術(shù)出血，另一方面手術(shù)創(chuàng)傷對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫功能也有顯著的抑制作用，尤其是腦膠質(zhì)瘤手術(shù)創(chuàng)傷較大，可使兒茶酚胺、糖皮質(zhì)激素等多種內(nèi)源性激素釋放入循環(huán)血液中，損害T細(xì)胞的增殖；并可導(dǎo)致前列腺素、血清抑制活性多肽等的產(chǎn)生和釋放，從而抑制患者的免疫功能。(3)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后5～7 d外周血DC1占單個(gè)核細(xì)胞的百分比高于術(shù)后1～3 d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。表明膠質(zhì)瘤患者在手術(shù)后一定時(shí)間段后機(jī)體的免疫功能抑制減少，患者腫瘤組織減少，腫瘤分泌的免疫逃避因子減少，免疫狀態(tài)好轉(zhuǎn)，而已知的研究結(jié)果表明術(shù)后的各種抑制作用在術(shù)后可持續(xù)4～10 d，然后才逐漸恢復(fù)[2-4]。作者認(rèn)為，一方面是腦腫瘤切除術(shù)后時(shí)間較短，盡管機(jī)體的細(xì)胞免疫功能有所恢復(fù)，但仍未達(dá)到正常水平；另外，由于手術(shù)創(chuàng)傷使患者細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制等所致，這種抑制可長(zhǎng)達(dá)3周，但這種抑制并非是細(xì)胞分化和發(fā)育異常，可能與淋巴細(xì)胞的異常分布有關(guān)。由于手術(shù)對(duì)機(jī)體組織的損傷及麻醉等均會(huì)造成嚴(yán)重干擾，可能在目前尚未明確的某種機(jī)制調(diào)節(jié)下，外周血淋巴細(xì)胞中的輔助T細(xì)胞較多地進(jìn)入淋巴結(jié)、扁桃體、脾臟等組織，而抑制性T細(xì)胞則較多地從上述組織中釋出，造成外周血輔助T細(xì)胞與抑制T細(xì)胞比值的相應(yīng)改變[5]。(4)腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后1～3 d及術(shù)后5～7 d患者外周血DC1/PBMC、DC2/PBMC均低于術(shù)前及健康者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明雖然膠質(zhì)瘤患者在手術(shù)后一定時(shí)間段機(jī)體的免疫功能抑制減少，免疫狀態(tài)好轉(zhuǎn)，但可能由于腦手術(shù)創(chuàng)傷及膠質(zhì)瘤無法完全切除，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞繼續(xù)分泌免疫抑制因子等，致使患者免疫狀態(tài)仍然低于術(shù)前。(5)不同惡性程度的腦膠質(zhì)瘤患者在圍手術(shù)期行DC1及DC2檢測(cè)分析提示，低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者DC1/PBMC、DC2/PBMC分別高于高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者，原因可能是高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者瘤體生長(zhǎng)更旺盛，浸潤(rùn)性更高，造成手術(shù)切除腫瘤困難，瘤體能夠分泌更多的免疫抑制及免疫逃避因子。

結(jié)果提示，腦膠質(zhì)瘤患者機(jī)體存在DC細(xì)胞亞群數(shù)量下降，從而影響病程。至于DC1、DC2下降的原因可能因腦內(nèi)存在DC或DC的前體細(xì)胞但含量很少，而在荷瘤宿主中腫瘤細(xì)胞還釋放一些免疫抑制因子，諸如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素10等可使DC凋亡或使其表面的分子表達(dá)發(fā)生變化，主要組織相容性復(fù)合體-Ⅱ類分子表達(dá)低，降低某些共刺激分子CD80、CD86等的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致DC的功能缺陷使其無法有效遞呈腫瘤抗原，不能激活T細(xì)胞以識(shí)別和殺傷[6-7]。近年來，DC應(yīng)用于膠質(zhì)瘤疫苗的研究報(bào)道較多，雖然取得了較大進(jìn)展，但目前仍然處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床前期階段[8-9]。大量研究表明，依據(jù)DC的生物學(xué)特性，可望制備相應(yīng)的DC疫苗，根據(jù)患者在圍手術(shù)期不同時(shí)間的免疫功能的變化及免疫功能與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系，為腦膠質(zhì)瘤的生物免疫防治提供一定的理論依據(jù)。

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貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合J字(2008)2201號(hào)]。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.034

A

1672-9455(2015)08-1112-02

2014-10-10

2014-11-20)