乙型肝炎病毒DNA在低溫儲(chǔ)存血漿中穩(wěn)定性的研究

謝 麗，鄧 燕，易 珍，陳學(xué)杰，黃 莉，李 山，秦 雪(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021)

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乙型肝炎病毒DNA在低溫儲(chǔ)存血漿中穩(wěn)定性的研究

謝 麗，鄧 燕，易 珍，陳學(xué)杰，黃 莉，李 山△，秦 雪(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南寧 530021)

目的 了解-20 ℃條件下儲(chǔ)存30 d后血漿中乙型肝炎病毒(HBV)脫氧核糖核酸(DNA)的穩(wěn)定性。方法 收集載量103～107copy/mL的30份乙型肝炎患者血漿，并分為低載量組、中載量組、高載量組。標(biāo)本采集后立即分離血漿并進(jìn)行基線(0 d)載量檢測(cè)，其余血漿于-20 ℃存儲(chǔ)，分別在第1、3、7、14、21和30天進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定。結(jié)果 (1)將30份樣本進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的配對(duì)t檢驗(yàn)，載量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：第1天與第0天比較(t=-0.327，P=0.746)；第3天與第0天比較(t=-0.718，P=0.479)；第7天與第0天比較(t=-0.682，P=0.500)；第14天與第0天比較(t=-1.072，P=0.292)；第21天與第0天比較(t=-0.818，P=0.420)；第30天與第0天比較(t=0.635，P=0.530)。(2)分組比較中，第30天與第0天比較，HBV DNA載量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：低載量組P=0.984；中載量組P=0.708；高載量組P=0.120。結(jié)論 -20 ℃儲(chǔ)存30 d，血漿標(biāo)本HBV DNA載量未出現(xiàn)連續(xù)下降或上升趨勢(shì)，且不同時(shí)間點(diǎn)與第0天的基線載量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

儲(chǔ)存時(shí)間； 乙型肝炎病毒； DNA； 穩(wěn)定性

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一。我國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，慢性乙型肝炎患者的高病毒載量與肝細(xì)胞性肝癌的發(fā)展密切相關(guān)[1]。目前，HBV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴血清特異性抗原抗體和DNA的檢測(cè)，包括時(shí)間分辨熒光分析法、酶免疫測(cè)定技術(shù)、放射免疫分析法和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)(RT-PCR)。前三種方法用于檢測(cè)HBV血清標(biāo)志物，是根據(jù)人體對(duì)HBV的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物及其抗體應(yīng)答系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，間接反映復(fù)制情況。而RT-PCR是檢測(cè)HBV的核酸，能更精確反映人體內(nèi)HBV的數(shù)量狀態(tài)，直接反映HBV復(fù)制傳染性的指標(biāo)。RT-PCR方法可用于診斷感染的慢性攜帶者、抗病毒治療后的療效評(píng)估、治療藥物的選擇及協(xié)助診斷因遺傳變異導(dǎo)致的血清學(xué)無(wú)法檢測(cè)者[2-3]。本研究將30份血漿標(biāo)本在-20 ℃條件下儲(chǔ)存30 d，在第1、3、7、14、21和30天的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，分析穩(wěn)定性，希望為相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 樣本取自2013年1～8月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科收治的乙型肝炎患者血漿30份，其中男22份，女8份；年齡16～45歲，平均28歲。其中，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎病毒e抗體(抗-HBe)、乙型肝炎病毒核心抗體(抗-HBc)3項(xiàng)陽(yáng)性即“小三陽(yáng)”者18例，HBsAg、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、抗-HBc 3項(xiàng)陽(yáng)性即“大三陽(yáng)”者12例。

1.2 血漿樣本 根據(jù)載量將30份無(wú)溶血的血漿樣本分成3組：(1)10份樣本為低載量(103～104copy/mL)，平均4 906 copy/mL，范圍在1 754～8 153 copy/mL；(2)10份樣本為中載量(104～105copy/mL)，平均52 647 copy/mL，范圍14 780～88 912 copy/mL；(3)10份樣本為高載量(105～107copy/mL)，平均1 002 528 copy/mL，范圍85 670～2 511 660 copy/mL。

1.3 RT-PCR檢測(cè)

1.3.1 樣本處理 每例患者收集10 mL的全血至含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝管(上?？迫A診斷醫(yī)療產(chǎn)品有限公司)，然后立即運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行離心分離(700 r/min離心10 min)。取離心后無(wú)溶血的血漿標(biāo)本1 mL立即進(jìn)行基線RT-PCR分析(0 d)，其余血漿分成6管，每管1.5 mL在-20 ℃存儲(chǔ)，分別在第1、3、7、14、21和30天取其中一份標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR。每次檢測(cè)前均進(jìn)行再次離心(700 r/min離心10 min)。

1.3.2 RT-PCR 核酸提取和RT-PCR均使用乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量測(cè)定試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)。在PCR反應(yīng)管中加入5 μL核酸釋放劑(試劑盒提供)，再加入5 μL待測(cè)血漿樣本，混勻后室溫靜置10 min，加入40 μL PCR反應(yīng)試劑，混勻后上機(jī)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增和循環(huán)條件為：55 ℃反應(yīng)2 min，94 ℃反應(yīng)5 min，再按94 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。每次運(yùn)行包含陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，陽(yáng)性定量參考品(試劑盒提供)，同血清樣本一起上機(jī)擴(kuò)增，判斷是否存在PCR抑制和防止假陽(yáng)性結(jié)果。反應(yīng)結(jié)束后，儀器根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)給出結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室室溫保持在22～24 ℃，相對(duì)濕度(65±5)% 。所有標(biāo)本都是由相同的技術(shù)人員在同等條件下完成。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)首先進(jìn)行l(wèi)og10轉(zhuǎn)換，應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。

2 結(jié) 果

2.1 不同時(shí)間點(diǎn)RT-PCR檢測(cè)的載量 在30份血漿標(biāo)本檢測(cè)過(guò)程中，所有對(duì)照都成功地被檢測(cè)，表明RT-PCR過(guò)程中無(wú)抑制和假陽(yáng)性現(xiàn)象。各組標(biāo)本在第0、1、3、7、14、21和30天RT-PCR檢測(cè)的平均載量值如表1所示。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)RT-PCR檢測(cè)的HBV載量(log10 copy/mL)

HBV低載量組10份標(biāo)本中，每毫升標(biāo)本拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)值3.192～3.911，在7個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的平均病毒載量相近，第0天與第30天平均病毒載量的常用對(duì)數(shù)值為3.638和3.639，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.021，P=0.948)。中載量組10份標(biāo)本中，每毫升標(biāo)本拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)值4.170～4.949，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的平均病毒載量相近，第0天與第30天平均病毒載量的常用對(duì)數(shù)值由4.658下降至4.648，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.387，P=0.708)。高載量組10份標(biāo)本中，每毫升標(biāo)本拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)值4.933～6.400，第0天與第30天平均病毒載量的常用對(duì)數(shù)值由5.747升高至5.780，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.717，P=0.120)。將30份樣本進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的配對(duì)t檢驗(yàn)，載量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第1天與第0天比較(t=-0.327，P=0.746)；第3天與第0天比較(t=-0.718，P=0.479)；第7天與第0天比較(t=-0.682，P=0.500)；第14天與第0天比較(t=-1.072，P=0.292)；第21天與第0天比較(t=-0.818，P=0.420)；第30天與第0天比較(t=0.635，P=0.530)。

圖1 第30天和第0天血漿樣本穩(wěn)定性比較

2.2 RT-PCR檢測(cè)的第30天與第0天HBV載量值比較 所有30份標(biāo)本RT-PCR檢測(cè)的第30天與第0天HBV載量值見(jiàn)圖1。其中，有4份標(biāo)本第30天HBV載量值與第0天相近或重疊(7號(hào)、9號(hào)、24號(hào)和30號(hào)標(biāo)本)；12份標(biāo)本為第30天HBV載量值較第0天低(0.044±0.030)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.085，P=0.000)；14份標(biāo)本為第30天HBV載量值比第0天稍高(-0.052±0.049)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.031，P=0.001)。全部樣本第30天與第0天比較，HBV載量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.635，P=0.530)。

3 討 論

到目前為止，RT-PCR是一種快速、敏感、實(shí)用的檢測(cè)方法。但是，在我國(guó)仍有許多醫(yī)院并未具備開(kāi)展檢測(cè)病毒載量的臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室。因此，部分乙型肝炎患者標(biāo)本只能定時(shí)定點(diǎn)地送往遠(yuǎn)離的病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室?？梢?jiàn)，當(dāng)務(wù)之急是如何保證血液標(biāo)本收集、處理和存儲(chǔ)方法正確、恰當(dāng)并優(yōu)化，以確保后續(xù)HBV載量檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

PCR技術(shù)中核酸提取是一個(gè)重要環(huán)節(jié)，本試驗(yàn)中采用一步法提取，無(wú)需對(duì)樣本進(jìn)行加熱、高速離心富集病毒等過(guò)程，能夠避免病毒核酸的損失，也避免了可能的核酸酶污染，從而使定量更準(zhǔn)確。Schafer等[4]認(rèn)為，延遲血漿樣本的處理可能導(dǎo)致巨細(xì)胞病毒PCR結(jié)果的假陽(yáng)性率增高。自從HBV檢測(cè)試劑盒商品化后，分析前質(zhì)量控制的重要性就不言而喻，如樣本收集、運(yùn)輸、處理等，延遲處理就可能導(dǎo)致細(xì)胞破壞、標(biāo)本溶血，影響PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性[4]。為排除血漿中不可預(yù)測(cè)的影響因素，本研究在每次測(cè)試前都對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)離心，從而有助于確保PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性，對(duì)于第30天載量測(cè)定與第0天之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義起一定的積極作用。

對(duì)于血清樣本的穩(wěn)定性，不僅儲(chǔ)存溫度、儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)其有影響，反復(fù)凍融也可能是影響因素之一。Sanlidag等[5]對(duì)5份血清樣本在首次采集后于-20 ℃凍存2 d，在隨后的10次反復(fù)溶解、凍存中檢測(cè)穩(wěn)定性，結(jié)果未見(jiàn)改變。表明對(duì)于臨床標(biāo)本無(wú)需采集后進(jìn)行小份分裝，不但減少工作強(qiáng)度，且在反復(fù)凍存、溶解10次內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果仍然有效。但是，該試驗(yàn)標(biāo)本較少，其可靠性仍需進(jìn)一步證實(shí)。而本試驗(yàn)中，每份標(biāo)本的檢測(cè)均為一次性凍存和溶解過(guò)程，排除了多次反復(fù)凍存溶解對(duì)結(jié)果的可能影響。結(jié)果顯示，不管是分為HBV低病毒載量組、中病毒載量組和高病毒載量組，或不分組分析，30份樣本的HBV平均載量值在第0天與其他6個(gè)時(shí)間點(diǎn)(第1、3、7、14、21、30天)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，試驗(yàn)中血漿樣本儲(chǔ)存于-20 ℃，結(jié)果與已發(fā)表的研究相似。Jose等[6]報(bào)道，血漿樣本在5、25 ℃儲(chǔ)存28 d，其穩(wěn)定性不變。Gessoni等[7]研究報(bào)道，血漿樣本丙型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV-1) 和HBV的穩(wěn)定性，在4 ℃條件下，HCV和HIV-1的核糖核酸能夠儲(chǔ)存72 h，HBV DNA能夠儲(chǔ)存7 d。

對(duì)于定量PCR檢測(cè)的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的可接受范圍，我國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心采用溯源至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品得出的檢測(cè)值換算成的對(duì)數(shù)值±0.4為可接受范圍[8]。試驗(yàn)的30份標(biāo)本，可能由于個(gè)體差異和技術(shù)固有誤差而導(dǎo)致第30天結(jié)果低于或高于第0天，分別比較后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但各對(duì)數(shù)值均在可接受范圍內(nèi)。當(dāng)不分組比較后，全部樣本第30天與第0天比較HBV載量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.635，P=0.530)，說(shuō)明升高或降低對(duì)臨床判斷影響極小。同樣，Baleriola等[9]報(bào)道，臨床樣品在-20、-70 ℃存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)9年后，檢測(cè)HCV、HIV、HBV載量，認(rèn)為其改變對(duì)于臨床判斷無(wú)影響。并且，F(xiàn)ung等[10]報(bào)道，冷凍保存105份臨床樣品12個(gè)月后，其HBsAg表達(dá)也無(wú)改變，仍可用于臨床監(jiān)測(cè)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，血漿標(biāo)本-20 ℃儲(chǔ)存30 d中，在第1、3、7、14、21和30天的6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，HBV載量未出現(xiàn)連續(xù)下降或上升的改變，且不同時(shí)間點(diǎn)與第0天的基線載量比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。希望能為相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)室提供有用的試驗(yàn)依據(jù)：如果未能每天進(jìn)行PCR檢測(cè)，可在一定時(shí)間內(nèi)(30 d)每周進(jìn)行幾次HBV載量的批處理測(cè)試；對(duì)于一些臨床需要復(fù)檢的結(jié)果，在排除不可預(yù)測(cè)的血漿因素后(如重復(fù)離心)，30 d內(nèi)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，其結(jié)果可信；實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)根據(jù)各自的技術(shù)條件對(duì)臨床標(biāo)本的儲(chǔ)存條件進(jìn)行優(yōu)化，以保障PCR檢測(cè)的規(guī)范性和結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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Stability of hepatitis B virus DNA in plasma in low temperature storage

XIELi,DENGYan,YIZhen,CHENXue-jie,HUANGLi,LIShan△,QINXue

(DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,GuangxiZhuangAutonomousRegion530021,China)

Objective To analyze stability of HBV DNA in 30 EDTA anticoagulants plasma in the order of magnitude between 1 000 and 10 000 000 copy/mL over a 30 day period.Methods Thirty plasma samples were grouped into three categories according to the viral loads,including low viral loads,intermediate viral loads and high viral loads.Ten milliliters of whole blood was freshly collected from each patient.Plasma samples without hemolysis were divided into 1 mL aliquots.One aliquot was processed immediately(Day 0) for baseline RT-PCR assays.The remaining aliquots were then processed after 1,3,7,14,21 or 30 day of storage at -20 ℃.Results There was no significant difference between the mean of the difference time point in viral loads following storage at -20 ℃ by paired-samples t test,including Day 1 compared to Day 0 (t=-0.327，P=0.746),Day 3 compared to Day 0(t=-0.718，P=0.479),Day 7 compared to Day 0(t=-0.682，P=0.500),Day 14 compared to Day 0 (t=-1.072，P=0.292),and Day 21 compared to Day 0 (t=-0.818，P=0.420).Day 30 compared to Day 0(t=0.635，P=0.530).Conclusion The concentration of HBV DNA in all samples stored at -20 ℃ for 30 days did not differ significantly from the baseline viral load,and it was not observed the trend in continued degradation in different time point( Day 1,3,7,14 and 21).

prolong period; cytomegalovirus; DNA; stability

謝麗，女，主管技師，在讀博士，主要從事基因組學(xué)方面的研究。

△通訊作者，E-mail：lis8858@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.023

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1672-9455(2015)08-1086-03

2014-12-05

2014-12-20)