Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響

劉忠志,張正洪(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北十堰 442000)

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Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響

劉忠志,張正洪(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,湖北十堰 442000)

目的 探討Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響，為闡明腦缺血后神經(jīng)血管新生的機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 選擇成年雄性遠(yuǎn)交群(SD)大鼠，建立缺血性腦卒中動物模型，采用Western blot方法測定梗死側(cè)與非梗死側(cè)Slit2和Robo4的表達(dá)。取原代培養(yǎng)10～14 d的神經(jīng)元種六孔板，分為加藥組H2O2(100 μmol/L)、對照組、H2O2(100 μmol/L)+Slit2 (3 μg/mL)組，行MTT方法檢測細(xì)胞活力與雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，梗死側(cè)Slit2和Robo4表達(dá)均較非梗死側(cè)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。100 μmol/L H2O2處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h會導(dǎo)致Slit2和Robo4表達(dá)升高(P<0.05)。MTT結(jié)果示，H2O2、H2O2+Slit2組細(xì)胞活力都有明顯下降，其中，H2O2+Slit2組的細(xì)胞存活率明顯高于單純H2O2組(P<0.05)。流式細(xì)胞學(xué)顯示，H2O2+Slit2組的細(xì)胞凋亡率明顯低于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 缺血性腦卒中有內(nèi)源性Slit2/Robo4信號通路的激活，而外源性Slit2可以促進(jìn)氧化應(yīng)激時神經(jīng)元的存活能力，抑制其凋亡作用，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用。

Slit2/Robo4信號通路； 缺血性腦卒中； 神經(jīng)元遷移

當(dāng)前我國的缺血性腦卒中的發(fā)病率逐漸增高，病死率在20%左右，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1]。眾所周知，當(dāng)腦組織遭受到缺血、缺氧和外傷等有害刺激時，機(jī)體會啟動自身的固有機(jī)制，可達(dá)到減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷的目的[2-3]。其中機(jī)體引起的氧化應(yīng)激會損傷細(xì)胞脂質(zhì)膜、蛋白及DNA，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。而腦組織中富含脂肪組織，對氧化應(yīng)激更敏感，因而,氧化應(yīng)激在腦缺血時更易引起神經(jīng)組織的損傷[4]。在治療中，積極促進(jìn)缺血性腦卒中神經(jīng)元的存活能力，抑制神經(jīng)元的凋亡，減少神經(jīng)元損失，能有效改善預(yù)后[5-6]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)的發(fā)展，許多研究者正關(guān)注于研究抑制內(nèi)源性缺血損傷反應(yīng)和增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用的途徑，從而促進(jìn)腦組織修復(fù)和再生[7]。20世紀(jì)末，Slit/Robo信號通路已經(jīng)被明確闡述為細(xì)胞膜外蛋白，具有排斥、引導(dǎo)神經(jīng)元軸突方向，控制神經(jīng)元遷移等作用[8]。其中Slit2在腫瘤細(xì)胞的代謝中起著重要的作用，Slit2對于神經(jīng)元的出芽和血管的再生作用可能與神經(jīng)再生有關(guān)，Robo4作為一種Slit的血管專門受體[9]。Slit2分別通過與Robo4結(jié)合后抑制血管的再生，同時，通過抑制水腫的形成和組織損傷在缺血發(fā)生后發(fā)揮保護(hù)作用[10]。另外有研究表明，缺血性腦卒中后有內(nèi)源性血管新生，新生的血管可更好地促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。為此，相關(guān)研究者逐漸開始致力于腦血管生成機(jī)制的研究，尋找治療缺血性腦卒中新的、更有效的治療策略[11-12]。本文具體探討了Slit2/Robo4信號通路在神經(jīng)元遷移中的活力與凋亡影響，希望為闡明腦缺血后神經(jīng)血管新生機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料 選擇成年雄性遠(yuǎn)交群(SD)大鼠，為出生后1～3 d SD新生鼠(200～250 g)，清潔級，由本院動物中心提供，符合動物倫理學(xué)和動物實(shí)驗(yàn)基本管理條例。

1.2 動物模型的建立 本文建立了缺血性腦卒中動物模型，其構(gòu)建措施為：SD大鼠進(jìn)行10%水合氯醛35 mL/kg麻醉、剪毛、消毒；選擇頸部正中切口，分離淺筋膜，暴露頸前肌群，可見頸總動脈，分離動脈鞘和迷走神經(jīng)。結(jié)扎頸總動脈近心端，蛙心夾夾閉頸外動脈，打結(jié)頸總動脈近分叉處；選擇7號頭皮針扎頸外動脈分叉處，閉合創(chuàng)口。2 h后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，選擇評分結(jié)果為1～3分為成功模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組 SD大鼠行線栓法大腦動脈阻斷缺血模型3 d后殺死，取雙側(cè)大腦半球，以非梗死側(cè)為對照組，選擇Western blot方法檢測Slit2/Robo4信號途徑分子Slit2和Robo4變化。然后取原代培養(yǎng)10～14 d的神經(jīng)元種六孔板，分為加藥組H2O2(100 μmol/L)及對照組，也采用Western blot方法檢測上述指標(biāo)的變化。同時，取原代培養(yǎng)10～14 d的神經(jīng)元種板，待24 h后細(xì)胞生長較為豐滿為加藥，分對照組、H2O2(100 μmol/L)組、H2O2(100 μmol/L)+Slit2(3 μg/mL)組，共3組，作用24 h后收集細(xì)胞行MTT方法檢測細(xì)胞活力，雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 缺血性腦卒中的Slit2/Robo4信號通路變化對比 經(jīng)過判定，動物模型都構(gòu)建成功，同時，用抗神經(jīng)元特異中間絲蛋白NESTIN抗體鑒定原代培養(yǎng)的神經(jīng)元。結(jié)果顯示，90%以上實(shí)驗(yàn)材料為NESTIN陽性細(xì)胞，即神經(jīng)元含量占90%以上。筆者采用Western blot方法測定梗死側(cè)與非梗死側(cè)Slit2和Robo4的表達(dá)，結(jié)果顯示梗死側(cè)Slit2和Robo4表達(dá)均較非梗死側(cè)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 動物模型中Shh信號傳導(dǎo)通路相關(guān)信號分子表達(dá)改變

2.2 神經(jīng)元氧化應(yīng)激Slit2/Robo4信號通路變化對比 筆者以100 μmol/L H2O2處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h，Western blot方法觀察Slit2/Robo4信號通路分子表達(dá)改變，結(jié)果均有Slit2和Robo4表達(dá)升高(P<0.05)，表明神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷早期即有Slit2/Robo4信號通路的激活。見圖2。

2.3 細(xì)胞活力及凋亡的影響 原代培養(yǎng)10～14 d的神經(jīng)元種六孔板，待24 h后細(xì)胞生長較為豐滿為加藥，分為對照組、H2O2(100 μmol/L)組、H2O2+Slit2組，作用24 h后收集細(xì)胞，觀察細(xì)胞凋亡及存活的改變。MTT結(jié)果示，H2O2、H2O2+Slit2組細(xì)胞活力都有明顯下降，其中H2O2+Slit2組的細(xì)胞存活率明顯高于單純H2O2組(P<0.05)，說明Slit2/Robo4信號通路可以促進(jìn)氧化應(yīng)激時神經(jīng)元的存活。流式細(xì)胞學(xué)顯示，H2O2+Slit2組的細(xì)胞凋亡率明顯低于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Slit2/Robo4信號通路氧化應(yīng)激時具有抗神經(jīng)元凋亡作用。見圖3、4。

圖2 氧化應(yīng)激Shh信號傳導(dǎo)通路相關(guān)信號分子表達(dá)改變

圖3 Hochest染色Shh對神經(jīng)元氧化應(yīng)激時神經(jīng)元凋亡的影響(定量)

圖4 Hochest染色對神經(jīng)元氧化應(yīng)激時神經(jīng)元凋亡的影響(定性)

3 討 論

當(dāng)前，對于缺血性腦卒中的有效治療手段仍非常有限，在腦缺血時，防御和應(yīng)激反應(yīng)可觸發(fā)和啟動一系列內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)，其作用機(jī)制涉及腺苷、神經(jīng)營養(yǎng)因子等多個環(huán)節(jié)。雖然目前內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用的存在和增強(qiáng)可顯著改善腦組織受損程度和預(yù)后已得到證實(shí)，但是具體機(jī)制還不明確[13]。

神經(jīng)的連接構(gòu)成了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育基礎(chǔ)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，軸突的生長受生長錐生長方向的分子調(diào)節(jié)和控制。一些軸突生長導(dǎo)向因子通過調(diào)節(jié)軸突生長時的吸引排斥信號影響軸突生長，這種信號調(diào)控也有助于血管的再生[14]。神經(jīng)生長導(dǎo)向分子與生長抑制分子都由軸突延伸的四周和靶組織細(xì)胞產(chǎn)生，其可以與相應(yīng)的特定受體分子作用，引導(dǎo)軸突靶向延伸，一些經(jīng)典的神經(jīng)生長導(dǎo)向因子在腦缺血時對神經(jīng)元和血管均可起到促進(jìn)新生進(jìn)而改善神經(jīng)功能恢復(fù)的作用[15]。而Slit是發(fā)現(xiàn)的第一種對神經(jīng)生長和神經(jīng)元遷移都有導(dǎo)向作用的因子，促進(jìn)軸突向正確的方向延伸，同時，對神經(jīng)元的遷移也有導(dǎo)向作用[16]。Slit可與其跨膜受體Roundabout(Robo)蛋白家族相結(jié)合，受體Robo主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，Slit/Robo不僅參與生理病理情況下的突觸可塑性調(diào)節(jié)，而且還參與了各種腫瘤細(xì)胞的生長以及腫瘤血管生成的調(diào)節(jié)。研究已證明，在大鼠全腦缺血模型及神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞模型中，Slit可以減少神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的死亡，并且Slit/Robo對神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有直接的保護(hù)作用。

本文結(jié)果顯示，梗死側(cè)Slit2和Robo4表達(dá)均較非梗死側(cè)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示在損傷早期即有Slit2和Robo4表達(dá)的明顯上調(diào)，提示Slit2/Robo4信號傳導(dǎo)通路可能為快速損傷反應(yīng)因子，可能是一個對損傷反應(yīng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。有研究也認(rèn)為Slit2與Robo4相結(jié)合，能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，從而抑制血管的再生，表明Slit2激動Robo4后會抑制VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、重組和構(gòu)建[17]。

筆者以100 μmol/L H2O2處理原代培養(yǎng)神經(jīng)元24 h，Western blot方法觀察Slit2/Robo4信號通路分子表達(dá)改變，結(jié)果均有Slit2/Robo4表達(dá)升高(P<0.05)，表明神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷早期即有Slit2/Robo4信號通路的激活，同時缺血及其他損傷可以促進(jìn)神經(jīng)再生[18]。

凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡，許多刺激因素可以通過激活凋亡傳導(dǎo)途徑及級聯(lián)放大反應(yīng)等引起細(xì)胞凋亡。本文流式細(xì)胞學(xué)顯示，H2O2+Slit2組的細(xì)胞凋亡率明顯高于H2O2組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Slit2/Robo4信號通路氧化應(yīng)激時具有抗神經(jīng)元凋亡作用。在神經(jīng)發(fā)育的早期階段，Slit2/Robo4信號通路參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，對正常發(fā)育的維持起到重要作用[19]。而在缺血性腦卒中，細(xì)胞凋亡是缺血半暗帶區(qū)缺血再灌注損傷時細(xì)胞死亡的主要形式之一，缺血可誘發(fā)Slit2的表達(dá)，提示Slit2/Robo4信號通路在腦卒中通過抗凋亡途徑可能具有潛在的治療作用。

總之，缺血性腦卒中有內(nèi)源性Slit2/Robo4信號通路的激活，而外源性Slit2可以促進(jìn)氧化應(yīng)激時神經(jīng)元的存活能力，抑制其凋亡作用，從而起到神經(jīng)保護(hù)作用，也提示Slit2/Robo4可能是缺血性腦卒中的一個重要的新的治療靶點(diǎn)。

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The viability and apoptosis effects of Slit2/Robo4 polarity signaling in neuronal migration

LIUZhong-zhi,ZHANGZheng-hong

(Departmentofinternalmedicine,AffiliatedDongfengHospitalofHubeiMedicalCollege,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To investigate the viability and apoptosis effects of Slit2/Robo4 polarity signaling in neuronal migration for providing theoretical and experimental mechanisms basis for elucidating cerebral ischemia angiogenesis.Methods Adult male SD rats were established animal models of ischemic stroke,the expression of non-infarct infarction side Slit2 and Robo4 were measured by the Western blot method.The neurons cell by 10-14 days primary cultured were selected and switched to six-well plat,there were divided dosing group H2O2(100 μmol/L),the control group and H2O2(100 μmol/L)+Slit2(3 μg/mL) group,the cell viability were detected by MTT and double staining apoptosis were detected by flow cytometry.Results Western blot showed infarction side Slit2 and Robo4 expression were significantly higher than that of non-infarcted side(P<0.05).When treated by the 100 μmol/L H2O2treatment of primary cultured neurons 24 hours will cause increased expression of Slit2 and Robo4(P<0.05).MTT results shown the H2O2,H2O2+Slit2 groups had significantly decreased in cell viability,which the cell survival rate of H2O2+Slit2 group were significantly higher than those of H202group(P<0.05).The apoptosis rate of H2O2+Slit2 group were significantly lower than those of Slit2 H2O2group(P<0.05).Conclusion Ischemic stroke had Slit2/Robo4 endogenous pathway activated,and the exogenous Slit2 can promote the viability of the neuronal oxidative stress and inhibit apoptosis,thereby it can protect the neuro.

Slit2/Robo4 signaling pathway; ischemic stroke; neuronal migration

劉忠志，男，主治醫(yī)師，本科，主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床工作。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.015

A

1672-9455(2015)08-1065-03

2014-11-10

2014-11-22)