抗心律失常肽對(duì)抗柯薩奇B3病毒的體外研究*

伍 瓊，盛 蕾，洪李鋒(湖北省武漢市第五醫(yī)院心血管內(nèi)科/武漢大學(xué)廣慈醫(yī)院心血管內(nèi)科/江漢大學(xué)心血管研究所 430050)

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抗心律失常肽對(duì)抗柯薩奇B3病毒的體外研究*

伍 瓊，盛 蕾△，洪李鋒(湖北省武漢市第五醫(yī)院心血管內(nèi)科/武漢大學(xué)廣慈醫(yī)院心血管內(nèi)科/江漢大學(xué)心血管研究所 430050)

目的 觀察抗心律失常肽(AAP10)對(duì)柯薩奇B3病毒(CVB3)感染的原代小鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。方法 將BALB/C小鼠原代心肌細(xì)胞分為7組，每組12孔，分別為細(xì)胞對(duì)照組，病毒對(duì)照組，藥物干預(yù)組(A組、B組、C組、D組、E組)。用不同濃度的AAP10培養(yǎng)液干預(yù)100 TCID50 CVB3感染的心肌細(xì)胞，對(duì)比每組的細(xì)胞活性。結(jié)果 藥物干預(yù)組細(xì)胞活性高于病毒對(duì)照組(F=7.489,P<0.05)。其細(xì)胞活性與藥物濃度(r=0.942,P=0.005)及作用時(shí)間(r=0.993,P<0.05)均呈正相關(guān)。結(jié)論 AAP10具有明顯的抗病毒活性，呈劑量時(shí)間相關(guān)性，對(duì)CVB3感染的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

抗心律失常肽； 柯薩奇B3病毒； 原代心肌細(xì)胞

抗心律失常肽(AAP10)是人們最早從牛心房肌中分離提取的由6個(gè)氨基酸組成的物質(zhì)，經(jīng)人工合成為具有生物活性的小分子內(nèi)分泌激素即AAP10，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞間的縫隙連接通道，介導(dǎo)第二信使物質(zhì)，影響心肌組織的分化、心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，同時(shí)具有抗心律失常、抗栓，改善心肌缺血，預(yù)防心肌病及心力衰竭的作用[1]。臨床上病毒性心肌炎是以柯薩奇病毒(A組和B組)、腺病毒、巨細(xì)胞病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和流感病毒較常見(jiàn)。臨床觀察到SARS冠狀病毒和最近流行的甲型H1N1新型病毒也可致病毒性心肌炎，心肌炎呈現(xiàn)急性或慢性過(guò)程。輕可無(wú)癥狀，重至彌漫性心肌炎引起爆發(fā)性、致命性、充血性心力衰竭及嚴(yán)重的惡性心律失常[2]。本研究通過(guò)建立柯薩奇B3病毒(CVB3)感染所致的心肌細(xì)胞損傷體外模型，觀察AAP10抗病毒活性，為臨床治療病毒性心肌炎提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(MODEL2300 SHELAB，美國(guó))；倒置顯微鏡(NikonT300,日本)；臺(tái)式高速離心機(jī)(TGL-16C,上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(北京元業(yè)伯樂(lè)科技發(fā)展有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(北京市醫(yī)療設(shè)備廠)；生物安全柜(Costar公司，美國(guó))；電子天平(上海精密科學(xué)儀器公司天平儀器廠)等。胰蛋白酶(HyClone公司)；MEM營(yíng)養(yǎng)液，含10%的胎牛血清、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL(HyClone公司)；臺(tái)盼藍(lán)(Sigma公司)；AAP10(產(chǎn)品號(hào)：809838，杭州中肽生化有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)病毒 CVB3(武漢大學(xué)病毒研究所)經(jīng)人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞，CTCC提供)培養(yǎng)擴(kuò)增后，用Read-Much公式計(jì)算TCID50為：10-3.8/0.1 mL，小量分裝在-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 原代小鼠心肌細(xì)胞(江陰齊氏生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 AAP10對(duì)CVB3的抑制作用 單層培養(yǎng)好的原代小鼠心肌細(xì)胞分為3組，細(xì)胞對(duì)照組、病毒對(duì)照組、藥物干預(yù)組，每組12孔。其中藥物干預(yù)組根據(jù)濃度梯度分為：A組、B組、C組、D組、E組。96孔板中每孔加入5×104的小鼠原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，除細(xì)胞對(duì)照組外，其余各組均給予0.1 mL/孔含100 TCID50的CVB3病毒維持液，干預(yù)組分別再給予0.1 mL/孔的含5、10、15、20、25 μg/mL濃度的AAP10維持液，置5%CO237 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率、存活率及病毒抑制率的測(cè)定 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀態(tài)。用四氮唑鹽(MTT)法測(cè)各孔在570 nm波長(zhǎng)下第6、12、18、24、30、36、42、48小時(shí)的吸光度，即A值，觀察細(xì)胞活性與時(shí)間的相關(guān)性。按下述公式計(jì)算第24小時(shí)的細(xì)胞存活率及病毒抑制率，隨機(jī)計(jì)數(shù)自發(fā)搏動(dòng)頻率。細(xì)胞存活率(%)=(藥物組A值/對(duì)照組A值)×100%，病毒抑制率(%)=(藥物處理組平均A值-病毒對(duì)照組平均A值)/(正常對(duì)照組平均A值-病毒對(duì)照組平均A值)×100%[3]。

2 結(jié) 果

2.1 AAP10干預(yù)后心肌細(xì)胞形態(tài)觀察 干預(yù)后觀察到第24小時(shí)，病毒對(duì)照組細(xì)胞損傷壞死明顯，圓縮脫落，大部分漂浮在培養(yǎng)液中，藥物干預(yù)組細(xì)胞可保持部分貼壁生長(zhǎng)，藥物濃度較高組，細(xì)胞形態(tài)相對(duì)完整，搏動(dòng)相對(duì)有力，頻率較快，隨時(shí)間推移，到第36～48小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)逐漸穩(wěn)定，無(wú)進(jìn)一步損傷壞死。

2.2 心肌細(xì)胞活性、搏動(dòng)頻率、存活率及病毒抑制率的測(cè)定 藥物干預(yù)24 h后B、C、D、E組心肌細(xì)胞活性、搏動(dòng)頻率、D及E組心肌細(xì)胞存活率以及病毒抑制率均與病毒對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 干預(yù)后第24小時(shí)各組心肌細(xì)胞情況比較±s)

注：與病毒對(duì)照組相比，※★P<0.05。

表2 藥物干預(yù)組心肌細(xì)胞活性與藥物作用時(shí)間線性相關(guān)回歸分析

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)。

圖1 AAP10作用時(shí)間細(xì)胞活性曲線

2.3 心肌細(xì)胞活性時(shí)間曲線、藥物濃度曲線及相關(guān)關(guān)系 A組細(xì)胞活性與時(shí)間無(wú)相關(guān)性(r=0.513，P=0.193)，當(dāng)AAP10干預(yù)濃度較高(B、C、D、E組)時(shí)，心肌細(xì)胞活性與藥物作用時(shí)間呈線性正相關(guān)，見(jiàn)表2、圖1；選取干預(yù)24 h觀察心肌細(xì)胞活性與藥物濃度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者呈正相關(guān)(r=0.942,P=0.005,r2=0.888)，見(jiàn)圖2。

圖2 AAP10作用24 h藥物濃度細(xì)胞活性曲線

3 討 論

CVB3是臨床上最常見(jiàn)的引起病毒性心肌炎的微生物，病毒感染心肌細(xì)胞后，在心肌組織內(nèi)復(fù)制引起的損傷以及同時(shí)介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)引起的免疫損傷是其主要發(fā)病機(jī)制[3-4]。國(guó)外基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，40歲以下有接近20%的患者死于CVB3感染所致的病毒性心肌炎。在這個(gè)過(guò)程中，TLR3-IFNβ介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是主要的發(fā)病機(jī)制之一，蛋白酶激活受體則可通過(guò)增加及抑制效應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)該受體的表達(dá)。臨床上對(duì)該病較難確診，心肌活檢是目前惟一有效的方法，大多數(shù)患者難以接受，Omura等[5]通過(guò)生物信息研究分析病毒性心肌炎小鼠模型可能的檢測(cè)指標(biāo)來(lái)為臨床提供信息。Schumm等[6]則首次將1例通過(guò)心肌活檢確診的急性病毒性心肌炎患者繪制T1圖像，作為一種新的檢測(cè)手段指導(dǎo)臨床應(yīng)用。在治療方面，國(guó)外有研究通過(guò)開(kāi)發(fā)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞移植術(shù)來(lái)治療傳染性的病毒性心肌炎，也有通過(guò)激活基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)來(lái)治療該病[7-8]。國(guó)內(nèi)最新研究報(bào)道，通過(guò)注射特定的DNA疫苗來(lái)增強(qiáng)靶細(xì)胞免疫系統(tǒng)以及對(duì)抗病毒的保護(hù)能力進(jìn)行治療[9]。

AAP10作為一種人工合成的多肽，具有調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞代謝，減輕壞死程度及延緩凋亡的作用，對(duì)于急性缺氧的乳鼠心肌細(xì)胞的體外研究中具有顯著的心肌細(xì)胞保護(hù)作用。2009年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)AAP10具有增強(qiáng)細(xì)胞間傳導(dǎo)，抑制細(xì)胞間的解耦聯(lián)，其作用部位是心肌細(xì)胞間漿膜下的縫隙連接蛋白Cx43、Cx45,而非Cx40。另有研究發(fā)現(xiàn)，AAP10可通過(guò)增加縫隙鏈接蛋白的耦聯(lián)作用來(lái)抵抗并預(yù)防抗心律失常藥物引發(fā)的尖端流轉(zhuǎn)型室速的發(fā)生[10]。同時(shí)，Johnstone等[11]報(bào)道，AAP10能用于治療心律失常的機(jī)制主要是通過(guò)促使縫隙連接蛋白Cx43的表達(dá)來(lái)延長(zhǎng)細(xì)胞有絲分裂及細(xì)胞周期，而并非是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞間潤(rùn)盤(pán)的連接通道功能來(lái)完成這一過(guò)程。還有研究報(bào)道，在缺血再灌注的小鼠模型中AAP10缺血后處理可大大減少細(xì)胞間解耦聯(lián)以及抑制室性心律失常的發(fā)生。而2008年發(fā)表在我國(guó)臨床心血管病雜志上的1篇報(bào)道是基于兔肥厚型心肌病模型的建立上，發(fā)現(xiàn)AAP10可通過(guò)顯著改善縫隙連接蛋白的分布來(lái)達(dá)到改善心肌細(xì)胞的重構(gòu)，防止Cx43排列紊亂，從而降低心律失常的發(fā)生率。因此，大多數(shù)研究認(rèn)為AAP10作為一種新型的抗心律失常藥物可逐漸替代目前市場(chǎng)上已有的抗心律失常藥物，避免其嚴(yán)重不良反應(yīng)的發(fā)生，而且對(duì)于缺血性心肌病、慢性房顫所致的獨(dú)特性的心肌損害有較為肯定的保護(hù)作用[12]。少數(shù)研究也發(fā)現(xiàn)，Cx43表達(dá)水平是冠狀動(dòng)脈閉塞后心肌梗死面積大小的一個(gè)關(guān)鍵因素，通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞間傳導(dǎo)來(lái)降低心律失常發(fā)生的藥物(如AAP10)可能會(huì)增大心肌梗死的面積；而有報(bào)道，縫隙連接阻滯劑可以減少心肌梗死面積和心肌局部缺血性室性心律失常的發(fā)生，故在AAP10的研究及使用上值得進(jìn)一步探討。

病毒性心肌炎患者由于病毒感染或病毒感染后免疫反應(yīng)引起的彌漫性或灶性心肌間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和鄰近的心肌纖維壞死或退行性變，導(dǎo)致不同程度的心功能障礙[13]。整個(gè)過(guò)程很有可能直接影響心肌細(xì)胞間的縫隙連接通道，并影響縫隙連接蛋白的正常表達(dá)及分布。從而推測(cè)AAP10作為一種心肌保護(hù)劑及縫隙連接蛋白激動(dòng)劑，給予一定的干預(yù)后可明顯保護(hù)心肌，減少損傷，促使細(xì)胞膜上縫隙連接蛋白的正常表達(dá)及分布，從而對(duì)抗病毒感染所致的心肌損害。本文通過(guò)建立CVB3感染小鼠原代心肌細(xì)胞的模型，來(lái)觀察給予AAP10藥物之后心肌細(xì)胞的改變，發(fā)現(xiàn)AAP10藥物干預(yù)組的心肌細(xì)胞受CVB3的損害明顯減少，其減輕程度與藥物濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)。體外研究中達(dá)到10 μg/mL以上的AAP10作用24 h后開(kāi)始體現(xiàn)出抗病毒活性，而20 μg/mL的AAP10作用24 h后就可明顯增加細(xì)胞存活率及病毒抑制率。因此，AAP10有明確的抵抗CVB3對(duì)心肌細(xì)胞造成的損害過(guò)程，這對(duì)于AAP10的藥理學(xué)及毒理學(xué)的研究具有參考價(jià)值，并對(duì)將來(lái)應(yīng)用于臨床上病毒性心肌炎的治療提供理論基礎(chǔ)。

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The vitro study of anti-arrhythmic peptide against coxsackie B3 virus*

WUQiong，SHENGLei△，HONGLi-feng

(DepartmentofCardiology,theFifthHospitalofWuhanCity/DepartmentofCardiology,MercyHospitalofWuhanUniversity/InstituteofCardiovascularSciencesofJianghanUniversity，Wuhan430050,China)

Objective To observe the anti-arrhythmic peptide 10(AAP10) against coxsackie virus B3 (CVB3) damage to the generation of myocardial cells in mice.Methods BALB/C mice primary myocardial cells can be divided into 7 groups,each group of 12 holes:the cell control group,the virus control group,and drug intervention group(five different concentrations).Myocardial cells of 100 TCID50 CVB3 were interventied with different concentrations of AAP10.Cell damage degree among each group were contrasted.Results Myocardial activity has a positive correlation with the drug concentration (r=0.942,P=0.005,r2=0.888) and action time(r=0.993,P<0.05).Myocardial activity in intervention group is significantly higher than virus control group(F=7.489,P<0.05).Conclusion AAP10 has obvious antiviral activity in vitro,which has a correlation with drug and action time.AAP10 can protect myocardial cell infected by CVB3 in vitro.

anti-arrhythmic peptide; coxsackie virus B3； primary cardiac myocyte

湖北省武漢市漢陽(yáng)區(qū)科學(xué)技術(shù)局計(jì)劃項(xiàng)目[陽(yáng)科(2011)11號(hào)]。

伍瓊，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事心臟病毒學(xué)及分子生物學(xué)方面的研究?！?/p>

，E-mail:309325285@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.012

A

1672-9455(2015)08-1056-03

2014-11-15

2014-12-01)