HCV早期感染者病毒載量與CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞相關(guān)性研究*

黃啟強，黃麗慶，周 青，肖 寒，黃伙榮，胡淑燕(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海 519100)

?

HCV早期感染者病毒載量與CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞相關(guān)性研究*

黃啟強，黃麗慶，周 青，肖 寒，黃伙榮，胡淑燕(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院，廣東珠海 519100)

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)早期感染者(抗原陽性、抗體陰性)的HCV病毒載量與CD4+CD25+叉頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3+)調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平的相關(guān)性，分析CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞在HCV感染中的作用。方法 應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ RT-PCR)技術(shù)檢測22例HCV核心抗原陽性、抗體陰性(即HCV Ag陽性、抗-HCV陰性)的早期感染病例、26例核心抗原陽性、抗體陽性(即HCV Ag陽性、抗-HCV陽性)的慢性HCV感染病例，24例核心抗原陰性、抗體陽性(即HCV Ag陰性、抗-HCV陽性)的既往HCV感染病例及22例健康對照組HCV RNA病毒載量；并用流式細胞技術(shù)檢測各組外周血有核細胞中的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平。結(jié)果 HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽性、抗-HCV陽性組，HCV Ag陰性、抗-HCV陽性組及健康對照組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞逐級下降，其中抗原陽性、抗體陰性組[(4.86±2.14)%]高于其他組[分別為(3.74±1.67)%、(2.74±1.27)%、(2.56±1.18)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.023、4.125、4.402，P<0.05)；HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞與HCV RNA病毒載量的對數(shù)(copy/mL,Ig)呈正相關(guān)(r=0.535,P<0.05)。結(jié)論 HCV早期感染者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平與高病毒調(diào)定點相關(guān)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平可能是加速HCV早期感染的影響因素之一。

HCV； 早期感染； 調(diào)節(jié)性T淋巴細胞； 病毒載量； 相關(guān)性

調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)對免疫平衡及維持免疫耐受具有重要意義，主要表現(xiàn)為免疫無能性和免疫抑制性，可以控制機體損傷的免疫反應(yīng)[1-2]。丙型肝炎病毒(HCV)感染者機體免疫功能紊亂，細胞免疫應(yīng)答在丙型肝炎的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。具有抑制活性的標(biāo)志性分子CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞在細胞免疫中起核心作用，對于維持免疫耐受及免疫平衡具有重要作用，病毒在體內(nèi)不能徹底清除，組織損傷遷延不愈等都與機體的免疫耐受息息相關(guān)，因此，檢測外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的水平可以較好地反映患者的免疫功能狀態(tài)[3-4]。在慢性乙型肝炎、人類免疫缺陷病毒等慢性感染中發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞比例升高，并調(diào)節(jié)病毒特異T細胞應(yīng)答[5-6]。在HCV慢性感染中，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞與疾病進展的關(guān)系有不少的研究，但由于研究對象和手段的不同，結(jié)果也不一致。陳瑜等[7]研究認為，外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞與療效相關(guān)，可作為肝衰竭療效評估及預(yù)后判定的指標(biāo)。彭明喜等[8]認為，現(xiàn)癥慢性化的HCV感染CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平較高。但由于研究對象及手段不同，導(dǎo)致的結(jié)果并不一致；對早期的HCV感染中，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平的研究還較少。本研究是以早期的HCV感染中病毒載量與CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞相關(guān)性進行探討，以CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平分析其在HCV致病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集22例HCV Ag陽性、抗-HCV陰性的早期感染病例；26例核心抗原陰性、抗體陽性的既往HCV感染病例；24例HCV Ag陽性、抗-HCV陽性的慢性HCV感染病例及22例健康者作健康對照組。

1.2 酶聯(lián)免疫吸咐試驗(ELISA)篩選HCV抗原和抗體 采用雙抗體(抗原)夾心ELISA。丙型肝炎核心抗原檢測試劑由基因重組表達的丙型肝炎病毒核心區(qū)抗原(HCV-cAg)免疫制備的抗丙型肝炎病毒核心單克隆抗體包被微孔板、辣根過氧化物酶標(biāo)志抗體(抗原)及陽性、陰性對照等組成，應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測人血清或血漿樣品中丙型肝炎病毒核心抗原(抗體)，按操作說明進行操作。用CUT OFF值來判讀結(jié)果(CUT OFF=2.1×陰性對照，≥CUT OFF值為陽性)。檢測儀器為雷杜RT6100酶標(biāo)儀；試劑由珠海麗珠生物工程有限公司生產(chǎn)；ELISA試劑盒。

1.3 FQ RT-PCR檢測丙型肝炎的病毒載量 (1)樣品RNA的抽提：標(biāo)準(zhǔn)或陰、陽性對照和待測血清100 μL加入100 μL RNA提取液1，13 000 r/min離心10 min，棄上清液后加25 μL提取液2完全溶解。(2)樣品cDNA合成：反應(yīng)體系10 μL混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV之前先70 ℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37 ℃水浴60 min，取出后立即95 ℃干浴3 min，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液。(3)加樣：在預(yù)定的反應(yīng)管中加入相應(yīng)體積的反應(yīng)體系38 μL；所定的反應(yīng)分別加入樣本、陰性對照、陽性對照和臨界陽性對照及標(biāo)準(zhǔn)工作品各2 μL于4 000 r/min離心5 s，至檢測區(qū)(PCR儀上)。(4)PCR抗增：反應(yīng)條件為37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，然后95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，熒光信號收集時設(shè)定為Fam熒光素，信號收集為60 ℃，儀器自動判讀結(jié)果；儀器為美國ABI型PCR擴增儀，由電腦自動分析計算HCV RNA定量結(jié)果；結(jié)果以copy/mL表示。HCV RNA試劑盒由深圳凱杰生物工程有限公司生產(chǎn)。

1.4 流式細胞技術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平及百分率 用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管(美國BD公司)采集全血，密度梯度離心機分離HCV感染者及健康對照外周血中單個核細胞(PBMC)。Foxp3+細胞的檢測應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)抗人Foxp3染色試劑盒(美國eBioscience公司)進行細胞染色，用BD公司的FACSCalibur流式細胞儀檢測各組中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞，具體方法如下：向流式1×106個PBMC中加入CD4-APC-Cy7抗體、CD25-APC抗體、CD3-PE-Cy7抗體(美國BD公司)40 ℃避光染色30 min，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌后加入1 mL的破膜/固定劑，40 ℃避光染色40 min，洗滌后加入2%(2 μL)的鼠血清，40 ℃避光15 min，加入Foxp3-FITC抗體及同型對照，40 ℃避光30 min，洗滌后加入含1%聚甲醛的PSB重懸液，用流式細胞儀進行分析，以FSC、SSC、CD3-PE-Cy7、CD4-APC-Cy7定義淋巴細胞，計算這一群內(nèi)的CD25+Foxp3+細胞比率，CD4+T淋巴細胞絕對值用BD公司TruCOUNT管FACSCalibur流式細胞儀測定，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞絕對值=CD4+T淋巴細胞絕對值×調(diào)節(jié)性T淋巴細胞比率，美國BD公司原廠試劑。

2 結(jié) 果

2.1 研究對象臨床資料及實驗檢測結(jié)果 見表1。

表1 4組研究對象臨床及實驗室檢測結(jié)果±s)

注：-表示無數(shù)據(jù)。

2.2 HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平 通過單細胞水平檢測外周血PBMC中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平發(fā)現(xiàn)，HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽性、抗-HCV陽性組，HCV Ag陰性、抗-HCV陽性組以及健康對照組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞逐級下降，其中，抗原陽性、抗體陰性組[(4.86±2.14)%]高于其他組[分別為(3.74±1.67)%、(2.74±1.27)%、(2.56±1.18)%]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為2.023、4.125、4.402；P分別為0.049、0.000、0.000，P<0.05)。

2.3 病毒載量 HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組(4.18±1.70)，HCV Ag陽性、抗-HCV陽性組(3.80±1.40)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別與HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽性、抗-HCV陽性組中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平相關(guān)(r=0.535、0.452,P<0.05)。兩組間HCV RNA比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.846，P>0.05)。

3 討 論

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞作為天然調(diào)節(jié)性T淋巴細胞，是調(diào)節(jié)性T細胞的主要組成成分，F(xiàn)oxp3是調(diào)節(jié)性T淋巴細胞較為特異的標(biāo)志，與調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的功能密切相關(guān)，是定義CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的最佳標(biāo)志物。近年來，HCV感染呈上升趨勢，慢性化程度高，對肝臟損害嚴(yán)重，目前尚無特效藥及疫苗對丙型肝炎進行預(yù)防或治療。當(dāng)前認為HCV免疫耐受的機制可能不僅與病毒和宿主兩方面的因素有關(guān)，而且與病毒的基因、病毒變異、病毒載量以及宿主的年齡、種族、基因多態(tài)性、樹突狀細胞抗原遞呈功能低下等因素有關(guān)[9-10]。在抗病毒治療中，病毒血癥被有效抑制，但CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞不升高的感染者。因此，在HCV感染早期尋找免疫耐受機制對治療和探索新的免疫靶細胞具有非常重要的意義。近年來，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞在HCV感染發(fā)病機制中的作用越來越受到重視，一方面，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞能抑制機體的過度免疫損傷；另一方面，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞也可能有利于HCV持續(xù)的感染。本研究分別以HCV早期、既往、慢性感染者外周血為樣本，用PCR技術(shù)檢測HCV RNA病毒載量及用流式細胞技術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平，探討CD4+CD25+Foxp3+與HCV病毒載量的相關(guān)性，分析HCV早期感染的免疫調(diào)節(jié)作用，了解丙型肝炎病毒清除情況及丙型肝炎慢性化進程，為臨床有效治療和預(yù)防丙型肝炎病毒感染提供新的線索和方法。調(diào)節(jié)性T淋巴細胞是維持機體平衡的重要因素，在HCV感染早期，其與病毒進展的關(guān)系備受關(guān)注，但研究的結(jié)果并不一致。HCV感染早期，病毒與宿主的相互作用已決定了疾病的預(yù)后，這一時期的免疫應(yīng)答對于了解其在HCV感染疾病進程發(fā)揮的作用具有重要意義。

本研究通過研究早期HCV感染者Treg的變化，探討其在疾病進展中發(fā)揮的作用，結(jié)果顯示，HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組，HCV Ag陽性、抗-HCV陽性組，HCV Ag陰性、抗-HCV陽性組及健康對照組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞逐級下降，HCV Ag陽性、抗-HCV陰性組[(4.86±2.14)%]與各組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，且與HCV RNA呈正相關(guān)(r=0.535，P<0.05),提示HCV感染者體內(nèi)的免疫系統(tǒng)功能受到抑制，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞可能會促進病毒的應(yīng)答不完全，不能及時、有效地清除病毒，促使HCV的復(fù)制，這是導(dǎo)致丙型肝炎慢性化發(fā)展的一個因素。由于CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞可以抑制多種效應(yīng)功能，因此可以推測，感染HCV后，TregCD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞百分率升高，使CD4+細胞群中抑制性細胞比例升高，對效應(yīng)細胞有抑制作用，削弱抗病毒免疫，從而與高水平的病毒調(diào)定點有關(guān)，導(dǎo)致了HCV的持續(xù)感染；也可能是在HCV感染的免疫調(diào)節(jié)中，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的存在，使機體的效應(yīng)細胞和HCV之間維持機體的保護性免疫，避免過度激發(fā)免疫反應(yīng)而造成周圍組織的損傷，但也會造成HCV的持續(xù)存在，促進了丙型肝炎慢性化進程，具體的免疫機制有待進一步研究[11]。

綜上所述，早期HCV感染者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞的百分率與病毒載量有關(guān)，是評價早期HCV感染進展的指標(biāo)之一，為進一步探討HCV的致病機制及其與宿主免疫應(yīng)答的相互關(guān)系提供了線索。

[1]Sakaguchi S,Wing K,Yamaguchi T.Dynamics of peripheral tolerance and immune regulation mediated by Treg[J].Eur J Immunol,2009,39(9):2331-2336.

[2]Moriishi K,Matsuura Y.Pathogenesis of hepatitis C virus[J].Uirusu,2007,57(2):141-149.

[3]Murphy TJ,Ni Choileain N,Zang Y,et al.CD4+CD25+regulatory T cells control innate immune reactivity after injury[J].J Immunol,2005,174(5):2957-2963.

[4]張子寧,胡斯文,徐俊杰,等.中國HIV早期感染者CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞變化研究[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2011,34(8):712-716.

[5]卿克勤,楊朝國,劉蓉.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞變化水平及其與抗病毒療效的關(guān)系[J].檢驗醫(yī)學(xué),2013,28(9):811-814.

[6]Elpek KG,Yoleu ES,Franke DD,et al.Ex vivo expansion of CD4+CD25+Foxp3+T regulatory cells based on synergy between IL-2 and 4-1BB signaling[J].J Immunol,2007,179(11):7295-7304.

[7]陳瑜,毛衛(wèi)林,俞炯,等.肝衰竭患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細胞水平變化與療效的相關(guān)性研究[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2007,30(8):854-857.

[8]彭明喜,張哲,許德義,等.HCV感染者外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的檢測及意義[J].浙江醫(yī)學(xué),2009,7(2):38-40.

[9]Rehermann B,Nascimbeni M.Immunology of hepatitis B virus and hepatitis C virus infection[J].Nat Rev Immunol,2005,5(3):215-229.

[10]Fontenot JD,Rudensky AY.A well adapted regulatory contrivance:regulatory T cell development and the forkhead family transcription factor Foxp3[J].Nat Immunol,2005,6(4):331-337.

[11]Fazekas B,Landay AL.Regulatory T cells in HIV infection: pathogenic or protective participants in the immune response[J].Aids,2008,22(6):671-683.

The correlation study between viral load in the early HCV-infected patients and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells*

HUANGQi-qiang，HUANGLi-qing，ZHOUQing，XIAOHan，HUANGHuo-rong，HUShu-yan

(TheFifthAffiliatedHospitalofZunyiMedicalUniversity,Zhuhai,Guangdong519100，China)

Objective To study the correlation between HCV viral load in the early HCV-infected patients(antigen-positive antibody-negative) and CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells,and to know the function of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes in the HCV infections.Methods We will use the real-time quantitative polymerase chain reaction(FQ RT-PCR) technique to detect HCV RNA viral load in 22 cases of early infected patients with HCV core positive antigen negative antibody(positive HCV Ag,negative HCV Ab),26 cases of chronic HCV-infected patients with core positive antigen and positive antibody (positive HCV Ag,positive HCV Ab),24 cases of following HCV-infected patients with core negative antigen positive antibody (negative HCV Ag,positive HCV Ab) and 22 cases healthy controls.We also will use flow cytometry technique to detect the level of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes of nucleated cells in peripheral blood in each group.Results The CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes in the group of positive HCV Ag negative HCV Ab,the group of positive HCV Ag positive HCV Ab,the group of negative HCV Ag positive HCV Ab and healthy control group is step-down,of which the group of original positive antibody negative antigen (4.86±2.14)% is higher than other groups(3.74±1.67)%，(2.74±1.27)%，(2.56±1.18)%.The difference is statistically significant(tvalues were 2.023,4.125,4.402,P<0.05);CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes and HCV RNA viral load logarithmic (copy/mL,Ig) were positively correlated(r=0.535,P<0.05) in core positive antigen negative antibody group.Conclusion The level of CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes in HCV early infections is associated with the set-point of high virus.CD4+CD25+Foxp3+regulatory T lymphocytes level may be one of the factors to speed up the early HCV infection.

HCV; early infection; regulatory T lymphocytes; viral load; relevance

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金課題(A2013647)。

黃啟強，男，副主任檢驗師，本科，主要從事免疫微生物學(xué)檢驗方面的研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.008

A

1672-9455(2015)08-1045-03

2014-11-05

2015-01-17)