慢性丙型肝炎患者HCV基因分型與HCV-RNA濃度和凝血功能關(guān)系的探討*

姜樹朋，李 艷，汪 明，喬 斌(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060)

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·論 著·

慢性丙型肝炎患者HCV基因分型與HCV-RNA濃度和凝血功能關(guān)系的探討*

姜樹朋，李 艷△，汪 明，喬 斌(武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060)

目的 探討慢性丙型肝炎病毒(HCV)患者基因分型與HCV-RNA濃度和凝血功能之間的關(guān)系。方法 選取該院HCV患者66例作為慢性HCV患者組，健康人群20例作為健康對(duì)照組。對(duì)該院66例HCV患者采用ABI3500dx基因測(cè)序儀進(jìn)行外周血HCV-RNA基因分型檢測(cè)以及采用羅氏Light Cycler熒光定量PCR儀進(jìn)行外周血HCV-RNA定量檢測(cè)，對(duì)該院66例HCV患者和20例健康體檢者進(jìn)行凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、血漿纖維蛋白原(FIB)檢測(cè)。結(jié)果 在66例HCV患者中，分別檢測(cè)出1a、1b、2a、3a、3b 和6a 型6種病毒基因型，其中基因1型39例，非基因1型27例。不同HCV基因型患者血清HCV病毒濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCV基因1型和非基因1型之間比較，凝血功能差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HCV基因1型和非基因1型分別與健康對(duì)照組比較，凝血功能差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HCV-RNA濃度與PT、APTT、TT、FIB的相關(guān)性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)分別為0.020、0.002、-0.072、-0.088(P>0.05)；HCV-RNA低濃度組(<5.0×105U/mL)和高濃度組(≥5.0×105U/mL)之間凝血功能比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；HCV-RNA低濃度組和高濃度組分別與健康對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 不同基因型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關(guān)，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者；HCV基因分型和RNA病毒濃度與凝血功能各項(xiàng)指標(biāo)大小無(wú)關(guān)，但是HCV患者較健康人群凝血功能降低，對(duì)于HCV感染者有必要進(jìn)行凝血功能檢查，以便了解HCV患者凝血功能狀態(tài)，防止出現(xiàn)嚴(yán)重的出血。

慢性丙型肝炎； HCV基因分型； HCV-RNA濃度； 凝血功能

肝臟不僅是人體代謝的重要器官，同時(shí)也是合成多種凝血因子的重要場(chǎng)所，當(dāng)肝臟受損(如肝炎、肝臟纖維化、肝癌等)時(shí)，凝血因子合成減少，造成凝血時(shí)間延長(zhǎng)，容易發(fā)生內(nèi)臟出血，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。丙型肝炎病毒(HCV)感染是導(dǎo)致慢性肝病、肝臟纖維化、肝癌的常見原因。HCV由于其基因的高度變異，根據(jù)病毒株核苷酸序列的同源性差異，可將其分為不同的基因型。目前已知HCV至少可分為6型(HCV 1～6型)，各型又分為許多亞型(如1a、1b、2a、2b、3a等)。不同基因型的HCV對(duì)治療藥物(如聚乙二醇干擾素、利巴韋林)的敏感程度不同，確定HCV感染者基因型有助于臨床治療和合理用藥[1-2]。但是，關(guān)于HCV基因分型及病毒濃度與肝損傷之間關(guān)系不同的研究尚未得出統(tǒng)一的結(jié)論。本研究分析66例慢性丙肝患者HCV基因分型與HCV-RNA濃度、基因分型和凝血功能的關(guān)系，以及HCV-RNA濃度和凝血功能的相關(guān)性，進(jìn)一步探討HCV基因分型、病毒濃度和肝組織損傷之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 慢性HCV患者組：選取2013年8月至2014年8月于本院住院診治的慢性HCV患者66例，男36例，女30例;年齡20～70歲，平均35歲，診斷符合2010年版《丙型肝炎防治指南》的標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組：選取本院同時(shí)期健康體檢人群20例作為對(duì)照組,男10例，女10例;年齡20～70歲，平均39歲。

1.2 方法

1.2.1 HCV-RNA基因分型檢測(cè) 對(duì)慢性HCV患者HCV-RNA提取采用EDTA抗凝血漿TRIzol LS試劑提取法，提取后的RNA使用Thermo公司的RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄引物為隨機(jī)引物；測(cè)序引物Forward primer 5′-TTA ACC ACA TCM RCT CCG TGT G-3′,Reverse primer 5′-GTA CCT GGT CAT AGC YTC CGT RAA-3′，使用ABI3500dx基因測(cè)序儀測(cè)序，并將所測(cè)序列與HCV-RNA參考序列AF009606、AF271632和AF139594等(NCBI GenBank)進(jìn)行比對(duì)分析，得出檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2 HCV-RNA濃度的測(cè)定 采用凱杰生物工程(深圳)有限公司提供的HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒(定量檢測(cè)線性范圍：1.0×103～5.0×107U/mL)，在提取HCV-DNA后，使用羅氏Light Cycler熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)被測(cè)樣本中HCV-RNA濃度1.0×103～5.0×107U/mL，則測(cè)定結(jié)果有效，可直接報(bào)告相應(yīng)的RNA濃度；當(dāng)被測(cè)樣本中HCV-RNA>5.0×107U/mL時(shí)，結(jié)果報(bào)告為大于5.0×107U/mL，本研究HCV-RNA>5.0×107U/mL時(shí)，按5.0×107U/mL記錄；當(dāng)被測(cè)樣本中HCV-RNA<1.0×103U/mL時(shí)，結(jié)果報(bào)告為小于1.0×103U/mL，本研究HCV-RNA<1.0×103U/mL時(shí)，按1.0×103U/mL記錄；當(dāng)被測(cè)樣本結(jié)果無(wú)循環(huán)閾值，即Ct值時(shí)，結(jié)果報(bào)告為0.0 U/mL。

1.2.3 凝血功能檢測(cè) 采集慢性丙型肝炎患者及健康對(duì)照組枸櫞酸鈉抗凝血后，立即輕輕顛倒混勻，離心后，使用日本SYSMEX公司全自動(dòng)凝血分析儀CA-7000及配套試劑進(jìn)行凝血功能測(cè)定，即凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、血漿纖維蛋白原(FIB)4項(xiàng)。

2 結(jié) 果

2.1 HCV基因分型與HCV-RNA濃度 在66例慢性HCV患者中，分別檢測(cè)出1a、1b、2a、3a、3b 和6a 型6種病毒基因型，其中基因1型39例，非基因1型27例。不同HCV基因型患者血清病毒濃度(lg U/mL)比較：基因1型患者HCV-RNA濃度為6.83±0.84，非1型患者HCV-RNA濃度為6.24±1.33，P<0.05，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同基因型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關(guān)，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者。

2.2 HCV基因分型與凝血功能 見表1。HCV基因1型與非基因1型之間比較，即不同HCV基因型之間凝血功能的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在20例健康對(duì)照組中，凝血功能檢測(cè)結(jié)果：PT為(10.72±0.50)s，APTT為(24.30±2.13)s，TT為(18.0±1.09)s，F(xiàn)IB為(3.03±0.51)g/L。HCV基因1型和非基因1型兩組分別與健康對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 HCV基因1型與非基因1型凝血功能比較±s)

2.3 HCV-RNA濃度與凝血功能 HCV-RNA濃度與PT、APTT、TT、FIB的相關(guān)性差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)分別為0.020、0.002、-0.072、-0.088(P>0.05)。見表2。HCV-RNA高、低濃度組比較，即不同HCV-RNA濃度組之間凝血功能的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HCV-RNA低濃度組(<5.0×105U/mL)和高濃度組(≥5.0×105U/mL)與健康對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同HCV-RNA濃度組之間凝血功能的差異±s)

3 討 論

由于HCV病毒基因的高度變異，不同基因分型HCV病毒表現(xiàn)出了不同的生物學(xué)特性，包括病毒的復(fù)制能力和致病能力，在本研究66例慢性HCV患者中，基因1型39例，非基因1型27例，基因1型和非1型患者血清中HCV-RNA濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同基因分型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關(guān)，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者。本研究結(jié)果與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[3-6]。

PT主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀況，PT延長(zhǎng)主要見于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ減少，F(xiàn)IB缺乏，維生素K缺乏，DIC等；APTT主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，見于凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ減低，纖維蛋白原缺乏，抗凝物質(zhì)存在等；TT主要反映纖維蛋白原(即凝血因子Ⅰ)轉(zhuǎn)為纖維蛋白的時(shí)間，TT延長(zhǎng)見于低纖維蛋白原血癥、異常纖維蛋白原血癥。FIB主要反映纖維蛋白原的濃度，F(xiàn)IB減少見于肝損傷，低纖維蛋白原血癥，異常纖維蛋白原血癥等。

HCV基因分型不但與聚乙二醇干擾素的抗病毒療效相關(guān)，而且與肝臟組織的病理?yè)p傷相關(guān)，如1b型多見于失代償期肝硬化和原發(fā)性肝癌的患者，1a、2a、2b、3a型則多見于慢性HCV不合并肝硬化和肝癌患者，基因3a型與肝臟脂肪病變的關(guān)系比較密切[11]。劉志英等[12]對(duì)92例北京地區(qū)肝硬化和慢性HCV患者進(jìn)行的基因型分布比較結(jié)果表明，尚未發(fā)現(xiàn)HCV基因型因肝病嚴(yán)重程度而有所不同。本研究顯示，基因1型和非1型患者之間的凝血功能4項(xiàng)指標(biāo)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但HCV基因型是否與肝臟的組織損傷相關(guān)需要進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查進(jìn)一步明確。

雖然HCV特異性的細(xì)胞免疫可造成肝細(xì)胞的損傷，但更主要的是干擾細(xì)胞的代謝，同時(shí)，病毒蛋白直接刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生纖維組織，從而造成在多數(shù)慢性HCV肝炎患者的PT、APTT、TT和FIB常在相對(duì)低水平波動(dòng)[13-16]。說(shuō)明凝血功能指標(biāo)變化雖可反映肝細(xì)胞損害程度，但該指標(biāo)與HCV感染引起的肝組織炎性反應(yīng)程度和病情的嚴(yán)重程度不一定平行。其他學(xué)者的研究也顯示，HCV感染者中肝組織的損傷和HCV-RNA的病毒濃度無(wú)關(guān)，不能以病毒濃度來(lái)判斷肝組織的炎性反應(yīng)活動(dòng)程度[17-19]。

綜上所述，慢性HCV患者不同基因分型HCV感染與HCV的病毒濃度相關(guān)，基因1型患者HCV-RNA濃度高于非1型患者。HCV基因分型和RNA病毒濃度與凝血功能各項(xiàng)指標(biāo)大小無(wú)關(guān)，但是慢性HCV患者較健康人群，凝血功能降低。因此，對(duì)于HCV感染者有必要進(jìn)行凝血功能檢查，以便了解慢性HCV患者凝血功能狀態(tài)，防止出現(xiàn)嚴(yán)重的出血。

[1]Pol S,Corouge M.Treatment of hepatitis C:current status and perspectives[J].Rev Prat,2014,64(5):605-612.

[2]Alexopoulou A,Papatheodoridis GV.Current progress in the treatment of chronic hepatitis C[J].World J Gastroenterol,2012,18(42):6060-6069.

[3]嚴(yán)艷,李卓,郭向華,等．北京地區(qū)慢性丙型肝炎患者血清HCV-RNA定量檢測(cè)與基因分型的研究[J]．醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2007,20(7):756-757．

[4]Yoo TW,Donfield S,Lail A,et al.Effect of hepatitis C virus(HCV) genotype on HCV and HIV-1 disease[J].J Infect Dis,2005,191(1):4-10.

[5]Marrone A,Sallie R.Genetic heterogeneity of hepatitis C virus:the clinical significance of genotypes and quasispecies behavior[J].Clin Lab Med,1996,16(2):429-449.

[6]Bukh J,Miller RH,Purcell RH.Genetic heterogeneity of hepatitis C virus:quasispecies and genotypes[J].Semin Liver Dis,1995,15(1):41-63.

[7]Rehermann B.Hepatitis C virus versus innate and adaptive immune responses:a tale of coevolution and coexistence[J].J Clin Invest,2009,119(7):1745-1754.

[8] Zeisel MB,Fafi-Kremer S,Robinet E,et al.Adaptive immunity to the hepatitis C virus[J].Viruses,2009,1(2):276-297.

[9]Heim MH.Innate immunity and HCV[J].J Hepatol,2013,58(3):564-574.

[10]高得勇,張欣欣.丙型肝炎免疫發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志,2006,33(1):61-64.

[11]解瑩,謝晨.丙型肝炎病毒基因分型的研究進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2010,32(4):470-474．

[12]劉志英,魏紅山,戴旺蘇,等.北京地區(qū)丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒基因分型[J].中華流行病學(xué)雜志,2005,2(26):148-149．

[13]Felmlee DJ,Hafirassou ML,Lefevre M,et al.Hepatitis C virus,cholesterol and lipoproteins--impact for the viral life cycle and pathogenesis of liver disease[J].Viruses,2013,5(5):1292-1324.

[14]Koike K,Tsutsumi T,Yotsuyanagi H,et al.Lipid metabolism and liver disease in hepatitis C viral infection[J].Oncology,2010,78(1):24-30.

[15]Koike K.Steatosis,liver injury,and hepatocarcinogenesis in hepatitis C viral infection[J].J Gastroenterol,2009,44(19):82-88.

[16]Domitrovich AM,Felmlee DJ,Siddiqui A.Hepatitis C virus nonstructural proteins inhibit apolipoprotein B100 secretion[J].J Biol Chem,2005,280(48):39802-39808.

[17]李蘊(yùn)銣,凌偉,陳鳳新,等.慢性丙型肝炎患者脂類代謝與丙型肝炎病毒復(fù)制以及肝臟病理的關(guān)系[J].世界華人消化雜志,2010,18(17):1820-1823.

[18]王敏樂(lè),曉華,韓紅星,等.HCV-RNA病毒載量和肝臟病理的關(guān)系[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(13):1513-1514.

[19]Rodríguez-Iigo E,López-Alcorocho JM,Bartolomé J.Percentage of hepatitis C virus-infected hepatocytes is a better predictor of response than serum viremia levels[J].J Mol Diagn,2005,7(4):535-543.

Relationship between HCV genotypes with content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients*

JIANGShu-peng,LIYan△,WANGMing,QIAOBin

(DepartmentofClinicalLaboratory,RenminHospitalofWuhanUniversity,Hubei430060,China)

Objective To investigate the relationship between HCV genotypes with content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients.Methods 66 patients with chronic hepatitis C and 20 healthy control subjects in our hospital were enrolled in this study.The HCV genotypes were determined by ABI3500dx gene sequencing machine and the level of serum HCV-RNA was measured with Roche Light Cycler real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction system.The level of PT,APTT,TT,FIB detection in all cases was examined.Results In 66 cases of chronic hepatitis c patients,six virus genotypes were detected which were,1a,1b,2a,3a,3b and 6a,respectively.The genotype 1 was 39 cases,and the other of non-genotype 1 was 27 cases.The comparative difference level of serum HCV in patients with different HCV genotypes was statistically significant (P<0.05).As to the coagulation function,no significant difference of the genotype 1 and the non-genotype 1 was found(P>0.05)，and the difference between the healthy control and HCV genotype group(the genotype 1 and the non-genotype 1) in the coagulation function was statistically significant(P<0.05).The level of PT,APTT,TT,FIB were not related with HCV-RNA content with coefficient correlation 0.020,0.002,-0.072,-0.088,respectively(P>0.05).The different of coagulation function between the low HCV-RNA content group(<5.0×105U/mL) and high content group(≥5.0×105U/mL) had no statistical significance(P>0.05)，and the difference of coagulation function between HCV-RNA content group(The low HCV-RNA content group and high content group) and healthy control group was statistically significant(P<0.05).Conclusion The HCV genotype is associated with HCV-RNA content in the serum,and HCV-RNA content with HCV genotype 1 patients is higher than those with non-genotype 1 patients.The relationship between HCV genotypes,the content of HCV-RNA and coagulation function in chronic hepatitis C patients is not apparent,but compared with healthy people,coagulation function of the patients with chronic hepatitis C decreases.The test of coagulation function is necessary for HCV infection in order to know the state of blood coagulation function in patients with chronic hepatitis C,and prevent severe bleeding.

chronic hepatitis C; HCV genotypes； HCV-RNA content; coagulation function

國(guó)家重點(diǎn)臨床?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目[財(cái)社(2010)305號(hào)]。

姜樹朋，男，在讀碩士研究生，主要從事個(gè)體化醫(yī)療與分子診斷方面的研究?！?/p>

，E-mail：yanlitf1120@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.08.001

A

1672-9455(2015)08-1027-03

2014-11-15

2014-12-22)