電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后的再生促進(jìn)作用及對IGF-1表達(dá)的影響

彭園園 張莉 劉通 陳玉佩 葛東宇 毛穎秋

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·論著·

電針“委中”穴對大鼠腰多裂肌損傷后的再生促進(jìn)作用及對IGF-1表達(dá)的影響

彭園園 張莉 劉通 陳玉佩 葛東宇 毛穎秋

目的 觀察電針委中穴對腰部多裂肌損傷后的干預(yù)作用及對胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)表達(dá)的影響，探求委中穴對大鼠腰肌損傷后再生修復(fù)的可能機(jī)制。方法 雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為空白組、模型對照組、模型組、電針委中組、電針腎俞組，共5組，觀察3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(4天、7天、14天)的變化，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)8個(gè)樣本。 將0.5%布比卡因鹽酸鹽溶液按每點(diǎn)100 μL注射于模型組和電針組大鼠L4、L5水平的多裂肌上。模型對照組采用同樣方法注射生理鹽水，空白組不做處理。造模后進(jìn)行電針雙側(cè)委中穴或腎俞穴分別治療4天、7天、14天，HE染色觀察肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，免疫組化方法檢測肌細(xì)胞IGF-1的表達(dá)。結(jié)果 造模前后多裂肌形態(tài)學(xué)改變顯著，損傷后第14天仍未完全恢復(fù)。電針委中組與電針腎俞組從形態(tài)學(xué)上優(yōu)于模型組。第4、7天模型組多裂肌IGF-1的表達(dá)顯著高于空白組(P<0.01)；第4天電針委中組表達(dá)顯著高于模型組(P<0.01)，電針委中組表達(dá)高于電針腎俞組(P<0.05)，電針腎俞組表達(dá)高于模型組(P<0.05)，而在第14天，電針腎俞組表達(dá)顯著高于模型組與電針委中組(P<0.01)。結(jié)論 電針委中穴和電針腎俞穴均能夠促進(jìn)大鼠腰多裂肌損傷后的再生，電針委中穴在肌肉損傷的早期效果顯著。

電針； 多裂肌損傷； 布比卡因； 委中； 腎俞； 胰島素樣生長因子1

位于腰部豎脊肌深面的多裂肌是穩(wěn)定腰椎的“鋼索”。以多裂肌為代表的腰部骨骼肌功能紊亂或損傷可導(dǎo)致各種急慢性腰痛[1-2]。研究表明，急性或慢性腰痛患者其多裂肌的I型和II型纖維會發(fā)生異常改變并伴有脂肪浸潤或出現(xiàn)多裂肌的萎縮。L4、L5節(jié)段的多裂肌對脊柱的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)最高，達(dá)70%以上[3]。因此，多裂肌損傷后的修復(fù)尤為重要。四總穴歌中的“腰背委中求”是委中穴治療腰背部疾病存在獨(dú)特療效的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，也體現(xiàn)了“經(jīng)脈所過，主治所及”的取穴原則。胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor 1,IGF-1)可以促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，并且選擇性的表達(dá)生肌調(diào)節(jié)因子。IGF-1是目前確定的唯一一種既參與肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖又參與肌母細(xì)胞分化的生長因子[4]。前期實(shí)驗(yàn)證明電針委中穴能夠促進(jìn)兔腰肌急性鈍挫傷后堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、結(jié)蛋白(desmin)以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的表達(dá)[5]。說明委中穴對腰肌急性鈍挫傷有促進(jìn)再生修復(fù)的作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察電針委中穴對布比卡因所致大鼠腰多裂肌毒性損傷后的再生修復(fù)作用及對IGF-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探求委中穴對腰部肌肉損傷后再生修復(fù)的部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

清潔級健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠120只，體重300～350 g。由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。分籠飼養(yǎng)，明暗周期12小時(shí)，自由飲食和飲水，環(huán)境溫度24℃，濕度40～50%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。大鼠按體重分層，隨機(jī)分為：空白組、模型對照組、模型組、電針委中組和電針腎俞組各24只，再隨機(jī)分為三個(gè)時(shí)間點(diǎn)4天、7天、14天，每組各8只。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 儀器 G6805-1電針治療儀(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)； RM2235石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)； DH-101電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(北京利康科技發(fā)展有限公司)；BX43顯微鏡(日本OLYMPUS公司)； Mshot MC50顯微成像系統(tǒng)(廣州市明美科技有限公司)。

1.2.2 試劑 布比卡因鹽酸鹽(美國sigma-FLUKA公司，生產(chǎn)批號：B5274-1G)；IGF-1抗體(美國millipore公司，生產(chǎn)批號：05-172)；小鼠超敏二步法檢測試劑盒(中杉金橋，生產(chǎn)批號：PV-9002)。

1.3 模型的建立和處理方法

1.3.1 造模 模型組和電針組大鼠10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后，選擇雙側(cè)脊柱L4、L5水平兩旁的4個(gè)點(diǎn)，使用一次性4號針頭注射器抽取0.5%布比卡因溶液，針頭緊貼棘突旁進(jìn)入肌肉，直到接觸關(guān)節(jié)突和乳突所在的骨面回抽套管1mm無血，表明針頭已到達(dá)多裂肌后注射布比卡因溶液400 μL(100 μL×4)，時(shí)間不得小于3秒，以利于藥物的吸收[6]，單次造模完成。模型對照組采用同樣辦法注射生理鹽水。

1.3.2 處理方法 電針委中組和電針腎俞組從造模后的第2天開始干預(yù)，將大鼠固定在特制的固定器上，分別暴露后肢和背部。采用華佗牌0.30×13 mm一次性針灸針，直刺進(jìn)針后連接電針儀，頻率2/10 Hz 疏密波，電流1～2 mA，持續(xù)20分鐘，每天1 次，直至取材前1天。參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]常用實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜，分別選取雙側(cè)“委中穴”(膝關(guān)節(jié)背面正中)和雙側(cè)“腎俞穴”(第2腰椎旁開7 mm)。

1.4 取材

分別在造模后的第4天、7天、14天每組同步取材8只。10%水合氯醛腹腔注射(350 mg/kg)麻醉后，剔除背部皮毛、筋膜，充分暴露腰部肌肉，剝離開最長肌和髂肋肌，銳性切取L4和L5水平多裂肌組織，置4%多聚甲醛溶液中固定。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 HE染色 4%多聚甲醛溶液固定48小時(shí)以上，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.5.2 免疫組化染色 將切片60℃ 烤片2小時(shí)，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，熱修復(fù)抗原，PBS沖洗，過氧化氫封閉10分鐘，滴加一抗，4℃孵育16小時(shí)，加二抗，DAB顯色，顯微鏡下觀察，出現(xiàn)棕黃色后即把切片放入自來水沖洗終止反應(yīng)。脫水透明，中性樹膠封片。利用無偏體視學(xué)技術(shù)，光鏡下(400×)全視野無偏采樣方法每張切片選取3個(gè)視野，采用image-professional plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測量每個(gè)視野中IGF-1陽性表達(dá)區(qū)域的平均光密度值(mean optical density，MOD)，取平均值為該樣本MOD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)變化

如圖1 所示：空白組和模型對照組多裂肌HE染色：肌細(xì)胞呈細(xì)長纖維狀，排列整齊，細(xì)胞核均勻的分布在細(xì)胞周圍。模型組：造模后第4天可見肌纖維廣泛變性壞死，此時(shí)，大部分壞死的肌纖維已被巨噬細(xì)胞吞噬，壞死區(qū)可偶見散在的未受損纖維束，電針委中組和電針腎俞組可見少量的新生幼稚纖維。至第7天，出現(xiàn)更多的新生紅色肌纖維，且直徑變大；委中組較腎俞組可見較多的紅色新生條狀纖維。至第14天，新生的肌纖維已接近正常肌纖維的形態(tài)，平行排列，部分中央核開始向細(xì)胞周圍遷移分化為成熟的肌纖維。由圖可見，在同一時(shí)間內(nèi)，電針委中組與電針腎俞組的肌纖維再生程度優(yōu)于模型組，尤其是電針委中組。從形態(tài)學(xué)上說明電針委中/腎俞可加快肌細(xì)胞的再生。

2.2 免疫組化IGF-1的表達(dá)

如圖2 所示：空白組與模型對照組IGF-1幾乎無表達(dá)，略高于背景，分布較均勻。造模后第4天各組均可見IGF-1強(qiáng)陽性表達(dá)，從圖2(D)可見左側(cè)未損傷肌細(xì)胞(uninjured muscle, UM)著色淺，右側(cè)損傷肌細(xì)胞(injured muscle，IM)著色深。造模后7天，IGF-1仍然呈陽性表達(dá)，腎俞組略高于模型組合委中組。造模后14天，IGF-1陽性表達(dá)減少。

圖像分析顯示，第4天、7天模型組多裂肌IGF-1的表達(dá)顯著高于空白組(P<0.01)。第4天電針委中組表達(dá)顯著高于模型組(P<0.01)，電針委中組表達(dá)高于電針腎俞組(P<0.05)，電針腎俞組高于模型組(P<0.05)。第7天，模型組、電針委中組、電針腎俞組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但腎俞組已表現(xiàn)出高于其他兩組的趨勢。第14天，電針腎俞組表達(dá)顯著高于模型組與電針委中組(P<0.01)，見表1。

A：正常組；B：模型對照組；C：模型組4d；D：電針委中組4d；E：電針腎俞組4d；F：模型組7d；G：電針委中組7d；H：電針腎俞組7d；I：模型組14d；J：電針委中組14d；K：電針腎俞組14d圖1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腰部多裂肌HE染色

A：正常組；B：模型對照組；C：模型組4d；D：電針委中組4d；E：電針腎俞組4d；F：模型組7d；G：電針委中組7d；H：電針腎俞組7d；I：模型組14d；J：電針委中組14d；K：電針腎俞組14d。 UM：未受損纖維；IM：受損纖維。圖2 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠腰多裂肌IGF-1的表達(dá)

組別4d7d14d空白組(n=8)0.019±0.0070.017±0.0090.020±0.003模型對照組(n=8)0.022±0.0050.021±0.0080.015±0.005模型組(n=8)0.158±0.061b0.089±0.021b0.039±0.030a電針委中組(n=8)0.263±0.047bde0.092±0.029b0.043±0.025b電針腎俞組(n=8)0.203±0.027bc0.107±0.015b0.079±0.010bdf

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01；與電針腎俞組比較，eP<0.05；與電針委中組比較，fP<0.01。

3 討論

全球約9.2%的人群受腰痛影響[8]，其中90%的腰痛患者為非特異性腰痛[9]，椎間盤源性腰痛占非特異性腰痛中絕大多數(shù)。脊柱及椎間盤的不穩(wěn)定是導(dǎo)致間盤源性腰痛的主要因素，而多裂肌是穩(wěn)定脊柱的重要肌群。臨床研究中發(fā)現(xiàn)很多急慢性腰痛患者均存在多裂肌功能異常或萎縮或伴有脂肪浸潤[3-5]。因此多裂肌損傷后的再生修復(fù)非常關(guān)鍵。胰島素生長因子(insulin-like growth factors ，IGFs)是肌肉再生和分化的關(guān)鍵生長因子。IGF-1可以促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，并且選擇性的表達(dá)生肌調(diào)節(jié)因子。布比卡因引起肌肉損傷后，在修復(fù)的初期伴隨IGF-1的自分泌并且調(diào)控MyoD的表達(dá)和肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活[10]。因此，IGF-1在肌肉再生中發(fā)揮非常重要的作用。

針刺在治療運(yùn)動系統(tǒng)疾病療效肯定，也是國內(nèi)外針刺研究者的主要研究方向之一。電針療法是針刺治療骨骼肌損傷研究中最常用的一種干預(yù)方法。臨床和實(shí)驗(yàn)室研究表明，電針在治療骨骼肌損傷能通過多種途徑取得療效[11-15]。委中穴是治療腰背部疾患的通用穴，它被高頻次的應(yīng)用于臨床[16-17]，或是單穴應(yīng)用或是眾穴協(xié)同均效驗(yàn)，“腰背委中求”是委中穴治療腰背部疾病存在獨(dú)特療效的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。腎俞穴是治療腰部疾病的另一常用穴[18]，腰為腎之府，又為局部取穴，可疏通局部氣血。本研究結(jié)果顯示，布比卡因引起多裂肌損傷后會使得IGF-1表達(dá)上調(diào)，電針委中穴和電針腎俞穴均能使IGF-1的表達(dá)增加。值得提出的是，在損傷早期(第4天)電針委中組IGF-1的表達(dá)高于電針腎俞組。隨后兩組IGF-1的表達(dá)均下降，但仍高于模型組。至第7天時(shí)兩組表達(dá)無差異，甚至出現(xiàn)腎俞組高于委中組的趨勢，到損傷的中后期時(shí)(第14天)電針腎俞組的表達(dá)卻顯著高于委中組。說明電針委中穴可在肌肉損傷的早期起到較好的作用，腎俞穴在肌肉再生的中后期仍然有效。即委中穴起效快而腎俞穴作用更持久。從形態(tài)學(xué)恢復(fù)上亦是如此。

委中穴治療腰背痛多以急性為主如急性腰扭傷、脊柱強(qiáng)直、坐骨神經(jīng)痛、腰椎間盤突出癥等，另外亦可治療、高熱抽搐、急性吐瀉等急癥[19]。也有研究表明針刺或刮痧委中穴可使同側(cè)腰部膀胱經(jīng)皮膚血流量即刻升高[20-21]。而腎俞穴多以治療慢性疾病為主如慢性腰肌勞損，腎虛腰痛、慢性疲勞綜合征等[22]。由此可見，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與中醫(yī)傳統(tǒng)理論以及臨床實(shí)踐具有一致性。

布比卡因引起的骨骼肌損傷初期伴有IGF-1的表達(dá)并激活肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行增殖分化，從而進(jìn)行骨骼肌的再生。電針委中穴能夠明顯改善大鼠腰多裂肌損傷后的組織形態(tài)學(xué)變化并增加生長因子IGF-1的表達(dá)，尤其是在肌肉損傷的早期，其作用優(yōu)于電針腎俞組。

[1] Huang Q, Zhang Y, Li D, et al. The Evaluation of Chronic Low Back Pain by Determining the Ratio of the Lumbar Multifidus Muscle Cross-ksectional Areas of the Unaffected and Affected Sides[J]. Journal of Physical Therapy Science, 2014, 26(10): 1613.

[2] 吳巍巍,胡志軍,范順武,等. 慢性腰痛對脊旁多裂肌萎縮影響的臨床研究[J]. 中國骨傷,2014, 27(3): 207-212.

[3] Silfies S P, Spuillante D, Maurer P, et al. Trunk muscle recruitment Pattems in specific chronic low hack pain populatios[J]. clin Biomech, 2005, 20(5): 465-473.

[4] Engert J C, Berglund E B, Rosenthal N. Proliferation precedes differentiation in IGF-I-stimulated myogenesis[J]. J Cell Biol, 1996, 135(2):431-440.

[5] 陳歡,彭博,李富運(yùn),等. 電針對兔腰肌急性鈍挫傷后組織修復(fù)與堿性成纖維細(xì)胞生長因子/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號通路的影響[J]. 中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2014,20(3):215-220.

[6] Toru Taguchi, Ulrich Hoheisel, Siegfried Mense. Dorsal horn neurons having input from low back structures in rats[J]. Pain, 2008, 138(1):119-129.

[7] 李忠仁. 實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)[M]. 中國中醫(yī)藥出版社,2003:316.

[8] Vos T, Flaxman A D, Naghavi M, et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010[J]. The Lancet, 2013, 380(9859): 2163-2196.

[9] Haldeman S, Kopansky-Giles D, Hurwitz EL, et al. Advancements in the management of spine disorders[J]. Best Pract Res Clin Rheumatol, 2012, 26(2): 263-280.

[10] Zanou N, Gailly P. Skeletal muscle hypertrophy and regeneration: interplay between the myogenic regulatory factors (MRFs) and insulin-like growth factors (IGFs) pathways[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70(21): 4117-4130.

[11] 王研,高維濱. 運(yùn)用T字型取穴法電針治療下肢肌肉損傷的臨床觀察[J]. 針灸臨床雜志,2012,28(9):23-25.

[12] 邢崇慧,李冬梅,張蔚. 電針配合超聲波治療運(yùn)動員肌肉損傷108例[J]. 上海針灸雜志,2004,23(5):18-19.

[13] 徐前威,王榮國,王云亭,等. 電針對兔鈍器傷后骨骼肌中轉(zhuǎn)化生長因子-β1和波形蛋白表達(dá)的影響[J]. 中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2014,29(5):421-426.

[14] 陳歡,張莉,崔強(qiáng),等. 電針阿是穴對骨骼肌損傷大鼠肌肉再生及堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響[J]. 中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2013,19(4):334-340.

[15] 馬憶南,楊華元,馮麟,等. 針刺誘導(dǎo)膠原信號變化對骨骼肌損傷的修復(fù)作用[J].中國組織工程研究,2012,16(42):7888-7892.

[16] 賈紅玲,張學(xué)偉,張永臣. 數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)在針灸治療腰痛古代文獻(xiàn)中的應(yīng)用[J]. 針灸臨床雜志,2013,29(11):40-45.

[17] 楊輝.腰痛的中醫(yī)辯證及針灸治療[J].中醫(yī)臨床研究,2011,3(20):70-71.

[18] 郭桂霞,張阿宏. 綜合護(hù)理雷火灸治療寒濕型腰肌勞損[J]. 實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2014,28(7):160-162.

[19] 卜彥青,杜廣中. 委中穴現(xiàn)代疾病譜[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2011,17(10):1137-1139.

[20] 徐青燕,楊金生,楊莉,等.委中穴區(qū)刮痧對本經(jīng)同側(cè)經(jīng)脈線上皮膚微循環(huán)血流灌注量的影響[J].針刺研究,2013,38(1):52-56.

[21] 王苓苓,張維波,謝衡輝,等.使用血流成像技術(shù)對“腰背委中求”經(jīng)典理論的驗(yàn)證[J].針刺研究, 2007,3(4):247-251.

[22] 金末淑,陳思宇,徐杉,等. 背俞穴研究進(jìn)展[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志,2009,16(S1):106-109.

(本文編輯：韓虹娟)

Effect of electroacupuncture at BL40 on morphology repairment and IGF-1 expression in rats with multifidus muscle injury

PENGYuan-yuan,ZHANGLi,LIUTong,etal.

SchoolofAcupunture-moxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China

ZHANGLi,E-mail:zhangli1572@sina.com

Objective To observe the effect of electroacupuncture on multifidus musle injury by morphological observation and insulin like growth factor 1(IGF-1) expression of rats with bupivacaine induced multifidus muscle toxicity, and discuss the possible mechanism of muscle tissue regeneration. Methods 120 male Sprague Dawley rats were randomly divided into blank group (BG), model control group(CG), model group (MG),Weizhong(BL40) electroacupuncture group (WG) andShenshu(BL23) electro-acupuncture group (SG), each group then was divided evenly into three time points (day4, day7 and day14) and each time point has 8 samples. Multifidus muscle (L4 and L5 sections) toxicity was established by injecting 0.5% bupivacaine hydrochloride, and normal saline injection as control (CG). The WG and LG accepted electro-acupuncture for 4d, 7d or 14d after modeling. The multifidus muscle of each rodent was stained with HE to observe pathological changes, and immune-histochemical staining was used to observe IGF-1 expression. Results Bupivacaine caused a process of degeneration-regeneration of the muscle fibers and did not normalize at day 14. WG and SG were recovered faster than MG. The expression of IGF-1 at day 4 ranked as MG higher than BG (P<0.01), WG higher than MG and SG (P<0.01,P<0.05), and SG higher than MG (P<0.05), while ranked as SG higher than MG and WG (P<0.01) at day14. Conclusion Electro-acupuncture at both BL40 and BL23 could promote the regeneration of tissue after multifidus muscle injury, and it seems better therapy effect when electro-acupuncture at BL40.

Electro-acupuncture;Multifidus muscle injury;Bupivacaine;BL40; BL23;IGF-1

國家自然科學(xué)基金(81141120)

100029，北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院[彭園園(碩士研究生)、張莉、劉通(博士研究生)、陳玉佩(碩士研究生)]，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(葛東宇)，科研實(shí)驗(yàn)中心(毛穎秋)

彭園園(1988- )，女，2012級在讀碩士研究生。研究方向：針灸臨床機(jī)理研究。E-mail：175808605@qq.com

張莉(1957- )，女，博士，博士生導(dǎo)師，教授。研究方向：針灸臨床機(jī)理研究。E-mail：zhangli1572@sina.com

R245

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.05.001

2014-12-18)