結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)在兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病中的診斷價(jià)值

賈晨光，姚黎明＊，李秀武，劉豐勝，章志華，張金文

（1.河北省胸科醫(yī)院骨科，河北 石家莊050041；2.河北省胸科醫(yī)院病理科，河北 石家莊050041；3.河北省胸科醫(yī)院科教處，河北 石家莊050041）

結(jié)核病（tuberculosis，TB）的診斷及控制是全球公共衛(wèi)生面臨的難題。目前我國(guó)仍然是兒童結(jié)核感染發(fā)病率及病死率較高的發(fā)展中國(guó)家之一［1］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的資料，2006年全球結(jié)核病例新增800萬(wàn)，兒童病例約130萬(wàn)，其中10%～20%為肺外結(jié)核［2］。骨關(guān)節(jié)結(jié)核是結(jié)核病在肺外器官最常見(jiàn)的類型，約占結(jié)核病總?cè)藬?shù)的13%左右，好發(fā)于兒童和青少年。對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染患者的快速診斷及成功治療是遏止結(jié)核病廣泛并快速傳播的核心步驟。在臨床工作中，準(zhǔn)確診斷兒童早期骨關(guān)節(jié)結(jié)核病尤為困難。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（tuberculosis infection of T cells spot test，TSPOT.TB）應(yīng)用于兒童活動(dòng)性結(jié)核診斷中的研究報(bào)道數(shù)量較少。本研究旨在評(píng)估T-SPOT.TB診斷兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年10月—2014年10月河北省胸科醫(yī)院骨科收治的診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核的患兒36例，男性26例，女性10例，年齡7個(gè)月～14歲，平均（7.40±4.27）歲。參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南》結(jié)核病分冊(cè)相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)病史、臨床特點(diǎn)、影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理學(xué)、病原學(xué)檢查結(jié)果以及抗結(jié)核治療效果進(jìn)行診斷。見(jiàn)表1。

表1 36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患兒臨床資料統(tǒng)計(jì)Table 1 Clinical characteristics of 36children patients confirmed with osteoarticular tuberculosis（n＝36，例數(shù)，%）

1.2 方法 所有患兒分別進(jìn)行涂片抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)、結(jié)核菌素PPD試驗(yàn)、T-SPOT.TB，比較其陽(yáng)性檢出率。根據(jù)病變部位（脊柱／四肢關(guān)節(jié)）及年齡段（年齡≤3歲，＞3～6歲，＞6～9歲，＞9～14歲）分別比較T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率。

1.2.1 涂片抗酸染色 所有診斷為骨關(guān)節(jié)結(jié)核病患者的標(biāo)本處理均依據(jù)“中國(guó)防癆協(xié)會(huì)指導(dǎo)方針”［3］進(jìn)行。將采集的關(guān)節(jié)腔積液、病灶膿液標(biāo)本，經(jīng)離心沉淀集菌后，用少量生理鹽水混勻沉淀物，均勻涂抹于載玻片上，自然干燥后，行抗酸染色鏡檢。

1.2.2 結(jié)核菌培養(yǎng) 將采集的關(guān)節(jié)腔積液、病灶膿液標(biāo)本經(jīng)消化處理后，接種于羅氏培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，接種后3d、7d觀察，此后每周觀察1次，有菌落生長(zhǎng)后用抗酸染色驗(yàn)證，若同時(shí)為陽(yáng)性記錄為陽(yáng)性，否則為陰性，至第8周仍無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)記錄為陰性。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 活檢或手術(shù)標(biāo)本采用熒光定量試劑盒檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。標(biāo)本經(jīng)去污和離心后，得到50μL DNA提取液，混勻后沸水煮10min，4℃放置6～8h。離心10 000r／min 5min，取上清用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.4 結(jié)核菌素PPD試驗(yàn) 注射0.1mL（5U）于患兒的前臂掌側(cè)皮內(nèi)，72h觀察注射部位的反應(yīng)情況。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照“中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃實(shí)施工作指南（2008版）”標(biāo)準(zhǔn)［4］：硬結(jié)直徑（d）＜5mm 為陰性（-）；5～10mm 為弱陽(yáng)性（＋）；＞10～20mm為陽(yáng)性（＋＋）；＞20mm或局部出現(xiàn)水泡、壞死或有淋巴炎為強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋）。

1.2.5 T-SPOT.TB 受試者用肝素鋰抗凝采血管抽取5mL靜脈血，即刻輕柔顛倒混勻3～5次，使抗凝劑充分溶解。3h內(nèi)將采集的全血分裝到3種不同的培養(yǎng)管中，“T”為添加了結(jié)核特異性抗原早期分泌抗原靶蛋白6、培養(yǎng)濾液蛋白10的測(cè)試培養(yǎng)管，“N”為本底對(duì)照培養(yǎng)管，“P”為添加了非特異刺激原植物血凝素的陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)管，每種培養(yǎng)管分裝1mL，分裝前需要顛倒混勻3次以上，分裝后輕柔顛倒培養(yǎng)管5次并立刻置于37℃培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)（22±2）h后取出，離心收集上清液，然后用雙抗體夾心法定量檢測(cè)上清中γ干擾素的含量，最后計(jì)算刺激培養(yǎng)系統(tǒng)中特異性升高的γ干擾素的量來(lái)判定是否為結(jié)核桿菌感染陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SSPS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各種檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率比較 T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率（75.00%，27／36）顯著高于涂片抗酸染色陽(yáng)性檢出率（8.33%，3／36）、結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率（50.00%，18／36），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01）；略高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)陽(yáng)性檢出率（61.11%，22／36）及結(jié)核菌素PPD試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率（66.67%，24／36），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 T-SPOT.TB與其他臨床常用檢測(cè)方法陽(yáng)性檢出率比較Table 2 The positive rate of T-SPOT.TB in comparison with other commonly used clinical methods （例數(shù)）

2.2 不同病變部位及年齡段T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率比較 36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患兒中包括22例脊柱結(jié)核和14例關(guān)節(jié)結(jié)核患兒，T-SPOT.TB診斷脊柱結(jié)核的陽(yáng)性檢出率高于四肢關(guān)節(jié)結(jié)核，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。36例骨關(guān)節(jié)結(jié)核患兒中年齡≤3歲10例，＞3～6歲4例，＞6～9歲6例，＞9～14歲13例，4個(gè)年齡段T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同病變部位和年齡段T-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率比較Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and age stages of osteoarticular tuberculosis（例數(shù)，%）

3 討 論

目前結(jié)核病在全球已呈現(xiàn)明顯回升趨勢(shì)，兒童病例數(shù)亦有顯著增加。在臨床實(shí)際工作中時(shí)常會(huì)遇到令醫(yī)師尷尬的現(xiàn)象，即依臨床體征、影像學(xué)表現(xiàn)高度懷疑骨關(guān)節(jié)結(jié)核病變，并有紅細(xì)胞沉降率增快、C反應(yīng)蛋白增高，但結(jié)核菌素試驗(yàn)、結(jié)核抗體和穿刺液涂片、TB-DNA、結(jié)核菌培養(yǎng)等結(jié)核方面的特異性檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性，甚至手術(shù)后病理結(jié)果僅提示慢性感染。由于抗結(jié)核藥物治療是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，一旦在誤診的條件下實(shí)施藥物治療，不僅會(huì)增加藥物不良反應(yīng)的危險(xiǎn)，骨關(guān)節(jié)破壞性病變也勢(shì)必加重，甚至產(chǎn)生不可修復(fù)的損害。在缺乏診斷結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)或病理學(xué)證據(jù)的前提下能否給予接受試驗(yàn)性抗結(jié)核藥物治療是擺在醫(yī)師與患兒家長(zhǎng)面前無(wú)法回避的共同難題。查閱文獻(xiàn)資料并結(jié)合我們的臨床工作體會(huì)，造成早期兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病診斷困難的原因可歸納為：①我國(guó)兒童普遍預(yù)防接種了卡介苗，機(jī)體對(duì)結(jié)核感染有一定抵抗能力，故早期兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核的臨床和影像學(xué)表現(xiàn)都不很典型；②患兒多為學(xué)齡前期兒童，故難于獲得準(zhǔn)確主訴甚至無(wú)主訴，增加了診斷上的困難；③兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病灶內(nèi)載菌量較低，故相應(yīng)組織學(xué)及病原學(xué)獲得陽(yáng)性結(jié)果較為困難［5］。

回顧以往傳統(tǒng)檢測(cè)方法各有不足：抗酸染色檢測(cè)法的陽(yáng)性率非常低，在本次研究中為8.33%（3／36）；被認(rèn)為是結(jié)核病臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的結(jié)核菌培養(yǎng)，因耗時(shí)長(zhǎng)（6～8周）、陽(yáng)性率低，而使其應(yīng)用受到限制；且以上檢測(cè)均為侵襲有創(chuàng)性操作，意味著患兒需承擔(dān)相應(yīng)痛苦及風(fēng)險(xiǎn)［6-7］?？梢?jiàn)以上方法對(duì)于篩選兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病并不是最理想的選擇。

由于原有的結(jié)核診斷方法存在自身無(wú)法克服的缺陷，T-SPOT.TB給現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)帶來(lái)快速、特異、靈敏準(zhǔn)確的結(jié)核感染診斷方法。目前，歐洲、加拿大、美國(guó)均已審批應(yīng)用，成為替代診斷結(jié)核感染的最主要方法［8］。該方法的基本原理是：當(dāng)體內(nèi)曾經(jīng)受到結(jié)核分枝桿菌抗原刺激而致敏的T淋巴細(xì)胞再次遇到同類抗原時(shí)能產(chǎn)生γ干擾素。通過(guò)進(jìn)行T-SPOT.TB，從單細(xì)胞水平檢測(cè)分泌γ干擾素的細(xì)胞數(shù)目，準(zhǔn)確判斷機(jī)體是否存在結(jié)核感染，輔助診斷結(jié)核病。

本研究TB-SPOT.TB陽(yáng)性檢出率為75.00%，與我們之前系列研究中報(bào)告的82.5%接近［9］，且在不同年齡段、不同病變部位（脊柱／四肢關(guān)節(jié)）間陽(yáng)性檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體現(xiàn)出對(duì)診斷各年齡段及不同病變部位的兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病均有良好的一致性。與上述傳統(tǒng)檢查相比，TB-SPOT.TB優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：①敏感度高，TB-SPOT.TB明顯優(yōu)于抗酸染色、結(jié)核菌培養(yǎng)；②快速安全簡(jiǎn)便，簡(jiǎn)單的血液檢測(cè)，隔天即報(bào)告結(jié)果，可避免對(duì)患兒造成創(chuàng)傷，特別是在病灶取活檢困難或外科手術(shù)指征不充分時(shí)；③特異性好，TB-SPOT.TB利用了結(jié)核分枝桿菌所特有的抗原靶6和培養(yǎng)濾液蛋白作為抗原刺激誘發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，只針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群敏感，對(duì)大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗無(wú)交叉反應(yīng)，而PPD是多種蛋白成分的混合物，其容易受到接種卡介苗和環(huán)境分枝桿菌感染的影響，診斷結(jié)核分枝桿菌感染和結(jié)核病特異性相對(duì)較低［10］。

綜上所述，T-SPOT.TB作為一種新的診斷技術(shù)，在兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的臨床診斷中具有較好的應(yīng)用價(jià)值，有助于探索并建立診斷兒童骨關(guān)節(jié)結(jié)核病的新方案。

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