lNSL3的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用前景

付俊玲（綜述），李乃適（審校）

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科，衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100730）

胰島素樣因子3（insulin-like 3，INSL3）是成熟睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig細(xì)胞）特異性分泌的一種蛋白類(lèi)激素。在正常男性體內(nèi)INSL3水平隨著性腺功能成熟而升高，隨著衰老后性腺功能減退而降低，因此，INSL3可用作反映男性生殖內(nèi)分泌功能的一種新型生物標(biāo)志物?，F(xiàn)將INSL3及其相關(guān)研究進(jìn)展綜述如下。

1 lNSL3簡(jiǎn)介

1.1 INSL3的結(jié)構(gòu) INSL3又稱(chēng)松弛素樣因子或睪丸間質(zhì)細(xì)胞源胰島素樣肽，屬于胰島素樣激素超家族［1］。其結(jié)構(gòu)與胰島素相似，INSL3蛋白合成時(shí)先形成蛋白前體肽，包括含24個(gè)氨基酸殘基的前體肽和A、B、C 3條肽鏈。如同胰島素的C肽，INSL3的C肽最終也被剪切，留下A-B肽鏈異二聚體。INSL3的B鏈C末端含有順序?yàn)镚-G-P-R-W（B22-26）的一段氨基酸序列，該序列是INSL3與其受體結(jié)合的關(guān)鍵部位。INSL3基因有一個(gè)單獨(dú)的開(kāi)放閱讀框（編碼180個(gè)氨基酸），與編碼胰島素、松弛素、胰島素樣生長(zhǎng)因子的前驅(qū)蛋白基因高度一致。因此，INSL3與胰島素從基因到蛋白的結(jié)構(gòu)都非常相似。

1.2 INSL3的來(lái)源 INSL3由INSL3基因編碼，人類(lèi)的INSL3基因位于19號(hào)染色體（p13.2～p12）。INSL3主要由男性睪丸的Leydig細(xì)胞（睪丸間質(zhì)細(xì)胞）特異性表達(dá)［2］，在男性的生命歷程中血清中INSL3水平隨著性腺功能的改變呈現(xiàn)波動(dòng)性的變化，青春期始逐漸升高，到了性成熟期，Leydig細(xì)胞中INSL3表達(dá)最高，同時(shí)血清中INSL3水平也達(dá)到最高，正常成年男性血清INSL3水平為（562.3±155.4）ng／L（放射免疫法）［3］；男性衰老后性腺功能逐漸減退，血清INSL3的水平也逐漸下降。Shirneshan 等［4］在 小 鼠 實(shí) 驗(yàn) 中 發(fā) 現(xiàn)，睪 丸Leydig細(xì)胞和卵巢卵泡膜細(xì)胞的INSL3mRNA濃度較高，且具有分化依賴性。因此，INSL3是人類(lèi)Leydig細(xì)胞分化成熟的標(biāo)記物。在女性中，INSL3在卵巢的卵泡膜細(xì)胞中也有表達(dá)［5］，但正常成年女性中血清INSL3水平極低，為（99.5±21.7）ng／L（放射免疫法）［3］，僅部分研究顯示多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患 者 血 清INSL3水平較正常女性明顯升高，因此有關(guān)女性的INSL3研究主要集中于PCOS患者人群。

1.3 INSL3的特異性受體 INSL3通過(guò)作用于其受體發(fā)揮作用，其受體被命名為富含亮氨酸的G蛋白偶聯(lián)受體8（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 8，LGR8），也稱(chēng)為影響睪丸下降的G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor affecting testisdescent，GREAT），由LGR8／GREAT基因編碼，其表達(dá)局限于引帶、睪丸、大腦和骨骼肌，主要高表達(dá)于引帶，其次是睪丸；該蛋白在睪丸下降過(guò)程中起重要作用。INSL3是LGR8蛋白的內(nèi)源性配體［6］，有研究表明，INSL3由Leydig細(xì)胞產(chǎn)生后通過(guò)旁分泌作用到達(dá)睪丸引帶，與其膜表面的LGR8受體結(jié)合，形成INSL3-LGR8復(fù)合物，通過(guò)G蛋白促進(jìn)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)睪丸引帶的生長(zhǎng)發(fā)育，睪丸位置下降。因此，INSL3-LGR8復(fù)合物在雄性分化過(guò)程中起重要作用。

2 正常雄性小鼠和男性血清lNSL3水平

2.1 正常小鼠體內(nèi)INSL3的表達(dá)情況 隨著雄性小鼠性腺的逐漸成熟，其血清INSL3水平逐漸升高；而隨著小鼠的衰老并出現(xiàn)性腺功能減退，血清INSL3水平也逐漸下降［7］。Anand-Ivell等［8］建立出生后雄性嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)其外周血中INSL3的分泌水平。該研究發(fā)現(xiàn)，血清INSL3水平直至實(shí)驗(yàn)小鼠20日齡始能在外周血中測(cè)出，40日齡時(shí)達(dá)到最高值（4～10μg／L），此時(shí)實(shí)驗(yàn)小鼠達(dá)到青春發(fā)育期，其Leydig細(xì)胞功能增強(qiáng)；以后又逐漸下降，到60日齡時(shí)達(dá)到了一個(gè)穩(wěn)定狀態(tài)；而衰老小鼠循環(huán)中INSL3水平明顯下降。Balvers等［9］研究發(fā)現(xiàn)青春期前的小鼠INSL3基因表達(dá)水平很低，成年后表達(dá)水平升高?？梢?jiàn)，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)血清INSL3水平在一定程度上與性腺功能有關(guān)。

2.2 正常男性體內(nèi)血清INSL3水平的變化 在正常男性的生命譜中，一方面，隨著男童逐漸進(jìn)入青春期，睪丸Leydig細(xì)胞逐漸成熟，血清INSL3水平會(huì)逐漸升高；另一方面，隨著人的衰老，Leydig細(xì)胞的功能逐漸減退，從而血清INSL3水平也會(huì)逐漸下降［10-11］。Wikstr?m 等［12］通 過(guò) 測(cè)定正 常 發(fā) 育期 男性體內(nèi)血清中INSL3水平，發(fā)現(xiàn)INSL3水平隨青春發(fā)育程度而逐漸升高；無(wú)論從骨齡的變化還是從臨床判斷的Tanner分期的增加來(lái)判斷青春發(fā)育水平，血清INSL3水平都隨著發(fā)育的逐漸成熟而逐漸升高，尤其以青春發(fā)育啟動(dòng)時(shí)升高明顯。Anand-Ivell等［13］用時(shí)間分辨免疫熒光法測(cè)定了1 160例南澳大利亞男性成年人的血清INSL3水平，發(fā)現(xiàn)血清中INSL3的含量隨衰老而下降，35～44歲之間的男性血清INSL3水平為（1.29±0.47）μg／L，而75～80歲男性血清INSL3水平為（0.79±0.39）μg／L。Ferlin等［14］對(duì)不同青春發(fā)育分期的75例健康男性青少年（Tanner分期Ⅰ～Ⅴ期，每期各15例）進(jìn)行了橫斷面研究，測(cè)定了所有參與者的血清INSL3、黃體生成素（luteotropic hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和雄激素（testosterone，T）水平，發(fā)現(xiàn)隨著Tanner分期的從低到高，血清INSL3水平逐漸上升。最近，Johansen等［15］又通過(guò)縱向研究探討了這一問(wèn)題，該研究為期5年，對(duì)10例青少年男性進(jìn)行了每半年1次的隨訪并檢測(cè)血清INSL3水平，發(fā)現(xiàn)青春期健康男性血清INSL3水平隨著青春期的啟動(dòng)、睪丸體積的增大及年齡的增長(zhǎng)而逐漸升高。因此，目前認(rèn)為INSL3可作為一種新型的青春期睪丸功能和分化的標(biāo)記物，提示INSL3在青春期各種發(fā)育異常疾病的診斷中有較好的應(yīng)用前景。

3 男性生殖內(nèi)分泌疾病與lNSL3

3.1 隱睪癥與INSL3 隱睪癥指嬰兒出生2個(gè)月以后，雙側(cè)或單側(cè)睪丸沒(méi)有下降到陰囊內(nèi)的一種畸形狀態(tài)。隱睪癥是泌尿生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的先天性疾病，是導(dǎo)致男性不育的重要因素，并且隱睪長(zhǎng)期處于高溫環(huán)境中可導(dǎo)致睪丸腫瘤的發(fā)生。

3.1.1 小鼠動(dòng)物模型的研究 小鼠體內(nèi)INSL3水平與隱睪癥的發(fā)病密切相關(guān)。Zimmermann等［16］發(fā)現(xiàn)INSL3基因敲除雄性小鼠出現(xiàn)了先天性隱睪，其睪丸引帶發(fā)育障礙，這表明INSL3對(duì)睪丸引帶的分化發(fā)育起到了決定性的作用。Nef等［17］發(fā)現(xiàn)INSL3基因敲除雄性小鼠出現(xiàn)精子發(fā)育異常和不育。用INSL3體外刺激睪丸引帶細(xì)胞，cAMP增加，提示INSL3可能促進(jìn)睪丸引帶的生長(zhǎng)。Foresta等［18］認(rèn)為L(zhǎng)eydig細(xì)胞分泌的INSL3能促進(jìn)雄性生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂，減少生殖細(xì)胞的凋亡。因此，從小鼠動(dòng)物模型的研究結(jié)果來(lái)看，可以認(rèn)為INSL3在隱睪癥的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

3.1.2 臨床研究 INSL3基因突變可導(dǎo)致隱睪已經(jīng)在臨床研究中證實(shí)。Tomboc等［19］和 Baker等［20］運(yùn)用單鏈構(gòu)象多態(tài)性的方法檢測(cè)了INSL3的2個(gè)外顯子序列，在2例隱睪患兒（1例為腹內(nèi)隱睪）的基因中發(fā)現(xiàn)了INSL3基因突變。Gorlov等［21］在61例患有單側(cè)或者雙側(cè)隱睪患者基因中發(fā)現(xiàn)了GREAT／LGR8基因突變。Ferlin等［22］和 Adham等［23］利用病例對(duì)照研究，在隱睪癥患者中發(fā)現(xiàn)了INSL3基因和其受體基因GREAT／LGR8的突變，突變率為9.2%，且所有表型的引帶發(fā)育均有改變。這些臨床研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了INSL3基因與隱睪癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系。

3.2 男性性腺功能減退癥與INSL3 男性性腺功能減退癥可分為高促性腺激素性性腺功能減退癥和低促性腺激素性性腺功能減退癥。但無(wú)論何種原因，Leydig細(xì)胞功能均未成熟，而血清INSL3水平也就低于正常。這一點(diǎn)在鑒別青春發(fā)育延遲的患者到底僅僅是發(fā)育延遲還是具有器質(zhì)性病變將會(huì)有潛在的意義；也就是說(shuō)，血清INSL3水平在某種程度上很可能能夠作為評(píng)價(jià)Leydig細(xì)胞功能的一個(gè)新指標(biāo)。

3.2.1 高促性腺激素性性腺功能減退癥 其病變部位位于睪丸本身，包括睪丸腫瘤、外傷和一些先天性疾病如Klinefelter綜合征等。典型的Klinefelter綜合征患者（染色體核型47，XXY）的Leydig細(xì)胞不能正常發(fā)育，曲細(xì)精管透明樣變，因而血清睪酮水平低，而垂體分泌的FSH和LH明顯升高。作為L(zhǎng)eydig細(xì)胞特異性分泌的激素，Klinefelter綜合征患者血清中INSL3水平理論上也應(yīng)較低。Ferlin等［3］和 Bay等［24］研究發(fā)現(xiàn)，Klinefelter綜合征患者血清INSL3水平較正常成年男性顯著降低。最近，Overvad等［25］利用病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，血清INSL3水平在Klinefelter綜合征男性體內(nèi)較正常成年男性約低70%。以上臨床研究均證實(shí)了Klinefelter綜合征患者血清INSL3水平處于較低水平。而Cabrol等［26］研究發(fā)現(xiàn)患有Klinefelter綜合征的嬰兒血清INSL3水平與正常嬰兒差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明該疾病患者血清INSL3濃度將停留在青春發(fā)育前的水平。因此，Klinefelter綜合征患者在青春發(fā)育啟動(dòng)年齡時(shí)LH和FSH均開(kāi)始升高，但睪丸Leydig細(xì)胞不能正常發(fā)育，睪酮水平并不相應(yīng)升高，于是負(fù)反饋調(diào)節(jié)使LH和FSH的分泌越來(lái)越多，最終達(dá)到一個(gè)極高的水平。但對(duì)于嵌合型（核型46，XY／47，XXY）的 Klinefelter綜合征患者，在青春發(fā)育啟動(dòng)年齡時(shí)Leydig細(xì)胞將有可能有一定的發(fā)育，這種情況下診斷有時(shí)將存在一定困難，此時(shí)血清INSL3水平極有可能成為協(xié)助診斷和評(píng)價(jià)生殖能力的一個(gè)新指標(biāo)。

3.2.2 低促性腺激素性性腺功能減退癥 患者病變部位在下丘腦-垂體，典型的一類(lèi)是Kallmann綜合征，因促性腺激素釋放激素（gonadotrophin releasing hormone，GnRH）神經(jīng)元在胚胎發(fā)育時(shí)未能遷移到正常位置而在青春期無(wú)法產(chǎn)生正常的GnRH，因而患者無(wú)法出現(xiàn)青春發(fā)育；同時(shí)Kallmann綜合征患者會(huì)伴有嗅覺(jué)缺失，因此一般來(lái)說(shuō)易于診斷。這樣，在無(wú)干預(yù)的情況下，該類(lèi)患者的睪丸Leydig細(xì)胞將處于幼稚狀態(tài)，而血清INSL3也將處于青春發(fā)育前水平。臨床上對(duì)該類(lèi)患者一般采用睪酮制劑的替代治療以促進(jìn)其第二性征的出現(xiàn)和維持，在患者擬生育時(shí)用GnRH泵治療或人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）和重組FSH治療以促進(jìn)精子生成。理論上可預(yù)測(cè)睪酮替代治療將抑制原本幾乎并未啟動(dòng)的下丘腦-垂體-性腺軸，從而進(jìn)一步抑制Leydig細(xì)胞功能，使INSL3水平下降。而GnRH泵或hCG聯(lián)合重組FSH的替代治療是模擬下丘腦-垂體-性腺軸的正常啟動(dòng)，因而將促使該類(lèi)患者的睪丸Leydig細(xì)胞正常發(fā)育，INSL3水平也應(yīng)相應(yīng)逐漸升高。

在臨床研究中，來(lái)自意大利［4］、丹麥［24］和法國(guó)［27］的研究均證實(shí)了這兩種治療方案對(duì)血清INSL3的影響。對(duì)這類(lèi)患者進(jìn)行促精子發(fā)生治療的一個(gè)難點(diǎn)是臨床如何判斷藥物療效，但精子發(fā)生在治療近3個(gè)月時(shí)方可觀察；而血清INSL3作為L(zhǎng)eydig功能的一種特異性標(biāo)志，對(duì)于定量或半定量評(píng)價(jià)治療的有效性將大有裨益。因此，血清INSL3水平在低促性腺激素性性腺功能減退癥的治療中也可能作為評(píng)價(jià)療效的新型指標(biāo)。

4 PCOS與lNSL3

INSL3在女性的意義目前尚未闡明。INSL3基因缺失性突變的雌性小鼠出現(xiàn)卵泡閉鎖和黃體溶解的增加，說(shuō)明INSL3可能在細(xì)胞凋亡通路上起到一定的作用［28］。現(xiàn)在已有少量關(guān)于 PCOS與INSL3關(guān)系的研究。PCOS是一種以持續(xù)排卵障礙、高雄激素血癥及胰島素抵抗為特征的生殖內(nèi)分泌紊亂的常見(jiàn)疾病。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者血清INSL3水平較正常成年女性顯著升高［29］，然而也有研究認(rèn)為二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，INSL3水平是否可能作為一種新的血清生物標(biāo)志物協(xié)助PCOS診斷和治療效果評(píng)價(jià)，尚需進(jìn)一步的研究。

5 展 望

血清INSL3水平隨著Leydig細(xì)胞功能的成熟而逐漸升高，因而它有望成為男性生殖內(nèi)分泌疾病的一種新的血清標(biāo)志物。一方面，血清INSL3水平可作為男性性腺功能減退癥的一個(gè)參照指標(biāo)；另一方面，它對(duì)于男性低促性腺激素性性腺功能減退癥患者的促精子生成治療也可以起到評(píng)判療效的作用。但將血清INSL3真正用于臨床實(shí)踐還需要開(kāi)展更加深刻而廣泛的研究。女性PCOS與INSL3的關(guān)系也有待于進(jìn)一步研究。

［1］ Bathgate RA，Halls ML，van der Westhuizen ET，et al.Relaxin family peptides and their receptors［J］.Physiol Rev，2013，93（1）：405-480.

［2］ Foresta C，Bettella A，Vinanzi C，et al.A novel circulating hormone of testis origin in humans［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89（12）：5952-5958.

［3］ Ferlin A，F(xiàn)oresta C.Insulin-like factor 3：a novel circulating hormone of testicular origin in humans［J］.Ann N Y Acad Sci，2005，1041：497-505.

［4］ Shirneshan K，Binder S，Bohm D，et al.Directed overexpression of insulin in Leydig cells causes a progressive loss of germ cells［J］.Mol Cell Endocrinol，2008，295（1／2）：79-86.

［5］ Hagen CP，Mieritz MG，Nielsen JE，et al.Longitudinal assessment of circulating insulin-like peptide 3levels in healthy peripubertal girls［J］.Fertil Steril，2015，103（3）：780-786，e781.

［6］ Kumagai J，Hsu SY，Matsumi H，et al.INSL3／Leydig insulinlike peptide activates the LGR8receptor important in testis descent［J］.J Biol Chem，2002，277（35）：31283-31286.

［7］ Paust HJ，Wessels J，Ivell R，et al.The expression of the RLF／INSL3gene is reduced in Leydig cells of the aging rat testis［J］.Exp Gerontol，2002，37（12）：1461-1467.

［8］ Anand-Ivell R，Heng K，Hafen B，et al.Dynamics of INSL3 peptide expression in the rodent testis［J］.Biol Reprod，2009，81（3）：480-487.

［9］ Balvers M，Spiess AN，Domagalski R，et al.Relaxin-like factor expression as a marker of differentiation in the mouse testis and ovary［J］.Endocrinology，1998，139（6）：2960-2970.

［10］ Ivell R，Anand-Ivell R.Biology of insulin-like factor 3in human reproduction［J］.Hum Reprod Update，2009，15（4）：463-476.

［11］ Ivell R，Heng K，Anand-Ivell R.Insulin-Like Factor 3and the HPG Axis in the Male［J］.Front Endocrinol（Lausanne），2014，5：6.

［12］ Wikstr?m AM，Bay K，Hero M，et al.Serum insulin-like factor 3levels during puberty in healthy boys and boys with Klinefelter syndrome［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（11）：4705-4708.

［13］ Anand-Ivell R，Wohlgemuth J，Haren MT，et al.Peripheral INSL3concentrations decline with age in a large population of Australian men［J］.Int J Androl，2006，29（6）：618-626.

［14］ Ferlin A，Garolla A，Rigon F，et al.Changes in serum insulinlike factor 3during normal male puberty［J］.J Clin Endocrinol Metab，2006，91（9）：3426-3431.

［15］ Johansen ML，Anand-Ivell R，Mouritsen A，et al.Serum levels of insulin-like factor 3，anti-Mullerian hormone，inhibin B，and testosterone during pubertal transition in healthy boys：a longitudinal pilot study［J］.Reproduction，2014，147（4）：529-535.

［16］ Zimmermann S，Steding G，Emmen JM，et al.Targeted disruption of the Insl3gene causes bilateral cryptorchidism［J］.Mol Endocrinol，1999，13（5）：681-691.

［17］ Nef S，Parada LF.Cryptorchidism in mice mutant for Insl3［J］.Nat Genet，1999，22（3）：295-299.

［18］ Foresta C，F(xiàn)erlin A.Role of INSL3and LGR8in cryptorchidism and testicular functions［J］.Reprod Biomed Online，2004，9（3）：294-298.

［19］ Tomboc M，Lee PA，Mitwally MF，et al.Insulin-like 3／relaxin-like factor gene mutations are associated with cryptorchidism［J］.J Clin Endocrinol Metab，2000，85（11）：4013-4018.

［20］ Baker LA，Nef S，Nguyen MT，et al.The insulin-3gene：lack of a genetic basis for human cryptorchidism［J］.J Urol，2002，167（6）：2534-2537.

［21］ Gorlov IP，Kamat A，Bogatcheva NV，et al.Mutations of the GREAT gene cause cryptorchidism［J］.Hum Mol Genet，2002，11（19）：2309-2318.

［22］ Ferlin A，Simonato M，Bartoloni L，et al.The INSL3-LGR8／GREAT ligand-receptor pair in human cryptorchidism［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88（9）：4273-4279.

［23］ Adham IM，Agoulnik AI.Insulin-like 3signalling in testicular descent［J］.Int J Androl，2004，27（5）：257-265.

［24］ Bay K，Hartung S，Ivell R，et al.Insulin-like factor 3serum levels in 135normal men and 85men with testicular disorders：relationship to the luteinizing hormone-testosterone axis［J］.J Clin Endocrinol Metab，2005，90（6）：3410-3418.

［25］ Overvad S，Bay K，Bojesen A，et al.Low INSL3in Klinefelter syndrome is related to osteocalcin，testosterone treatment and body composition，as well as measures of the hypothalamicpituitary-gonadal axis［J］.Andrology，2014，2（3）：421-427.

［26］ Cabrol S，Ross JL，F(xiàn)ennoy I，et al.Assessment of Leydig and Sertoli cell functions in infants with nonmosaic Klinefelter syndrome：insulin-like peptide 3levels are normal and positively correlated with LH levels［J］.J Clin Endocrinol Metab，2011，96（4）：E746-753.

［27］ Trabado S，Maione L，Bry-Gauillard H，et al.Insulin-like peptide 3（INSL3）in men with congenital hypogonadotropic hypogonadism／Kallmann syndrome and effects of different modalities of hormonal treatment：a single-center study of 281 patients［J］.J Clin Endocrinol Metab，2014，99（2）：E268-275.

［28］ Spanel-Borowski K，Sch?fer I，Zimmermann S，et al.Increase in final stages of follicular atresia and premature decay of corpora lutea in Insl3-deficient mice［J］.Mol Reprod Dev，2001，58（3）：281-286.

［29］ Pelusi C，F(xiàn)anelli F，Pariali M，et al.Parallel variations of insulin-like peptide 3 （INSL3）and antimullerian hormone（AMH）in women with the polycystic ovary syndrome according to menstrual cycle pattern［J］.J Clin Endocrinol Metab，2013，98（10）：E1575-1582.