基于普魯士藍納米材料的靶向診療一體化的研究

尹　翔，費海航

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 醫(yī)療設備處，江蘇 蘇州 215004)

基于普魯士藍納米材料的靶向診療一體化的研究

尹翔，費海航

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 醫(yī)療設備處，江蘇 蘇州 215004)

摘要：近年來，利用納米材料的光熱效應治療腫瘤成為了醫(yī)學研究的熱點。本文制備了PBMNPs，并對其紅外光譜、順磁性、近紅外光熱效應和近紅外光熱穩(wěn)定性進行了研究，分析了其細胞毒性和腫瘤磁靶向光熱治療中的效果。

關鍵詞：普魯士藍；光熱治療；磁靶向性

近年來，診療一體化的新型納米藥物研究成為癌癥治療的熱點。納米載藥體系不僅可以利用EPR效應實現(xiàn)被動靶向，還能對靶向分子進行修飾實現(xiàn)主動靶向，提高腫瘤組織附近納米藥物的富集度。

普魯士藍是一種染料，它的價格十分便宜，并且制備簡單，是一種醫(yī)院常規(guī)儲備的臨床用藥。經(jīng)過長期臨床實踐證明，它在人體內(nèi)的可靠性和安全性很高。由于普魯士藍具有良好的電化學可逆性，能使電子傳遞加速，所以，在免疫傳感器的制備中的應用前景十分廣泛。在生物傳感器中，以Fe304磁性納米粒子為核心制備出的PBMNPs(普魯士藍磁性納米粒子)應用也十分廣泛，這拓寬了普魯士藍在生物傳感器領域的應用范圍。在醫(yī)學診療一體化中應用基于普魯士藍的納米材料，將能解決多數(shù)納米材料生物安全性低且價格昂貴的難題。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

試劑：氯化鐵(北京市第十七中學化工廠)；氯化亞鐵(阿拉丁公司)；過氧化氫(天津市科密歐化學試劑有限公司)；鐵氰化鉀(國藥集團化學試劑有限公司)；胎牛血清(FBS，背景元亨圣馬生物技術研究所)；鈣黃綠素(分析純美國西格瑪試)。所有試驗用水均為去離子水。

儀器：傅里葉變換紅外光譜儀Excalibur(美國瓦里安公司)；熒光倒置顯微鏡 Olympus IX(日本奧林巴斯公司)；808 nm激光器T808D2W(西安銘輝光電科技公司)；真空干燥機DZF-6020(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；振動樣品磁強計LH-3(南京南大儀器有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1磁性四氧化三鐵(Fe3O4MNPs)的制備

Fe3O4MNPs的制備方法很多，最常用的化學合成方法為共沉淀法，這可能是最簡單、高效的磁性納米顆粒合成方法。Fe3O4MNPs的制備如下：2M FeCl2·4H2O 5 mL，1M FeCl3·6H2O 25 mL和2M HCl相混合，溶液混合后，氮氣除氧l0 min。在N2條件下，將混合的鐵鹽溶液逐滴加入到250 mL、0.7M無氧氨水中，室溫劇烈攪拌30 min。磁鐵分離，用超純水洗至中性，定容至250 mL，密封保存。取出部分膠體溶液，進行磁性分離，清洗。將分離產(chǎn)物置于真空干燥箱內(nèi)烘干，得到粉末狀Fe3O4MNPs。

1.2.2磁性普魯士藍納米離子(PBMNPs)的制備

將40 mL 0.04M FeCl3·6H2O與20 μL 30% H2O2混合得到溶液A；將40 mL 0.04M K3Fe(CN)6與20 μL 30%的H2O2混合得到溶液B，在攪拌狀態(tài)下，溶液A緩慢滴加到溶液B中，再加入20 mL Fe3O4MNPs儲備液，攪拌3 h，得到磁性普魯士藍納米粒子。取出部分膠體溶液，進行磁性分離、清洗。將分離產(chǎn)物置于真空干燥箱內(nèi)烘干，得到粉末狀PBMNPs。

1.2.3紅外光譜分析

試驗采用FT-IR(傅里葉變換紅外光譜)對制備的Fe3O4MNPs和PBMNPs進行紅外光譜分析。

1.2.4Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征

采用振動樣品磁強計對Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征進行研究。

1.2.5PBMNPs的近紅外光熱效應

為了研究PBMNPs的近紅外光熱效應，試驗采用激光器分別照射5 mL普魯士藍(100 ppm)、Fe3O4(100 ppm)、PBMNPs(100 ppm)水懸液，照射波長為808 nm，研究了在激光照射過程中它們的溫度變化[1]。

1.2.6PBMNPs的近紅外光熱穩(wěn)定性

選取濃度為50 ppm PBMNPs水懸液5 mL，激光器照射10 min，照射波長為808 nm，關閉激光器，讓溶液自然冷卻到初始溫度，再次開啟激光器繼續(xù)照射10 min，如此循環(huán)照射4次，考察該納米粒子在循環(huán)中的溫度變化。

1.2.7細胞毒性試驗

將正常的靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和濃度分別為0、20、40、80、160、320、400和500 ppm的PBMNPs共同接種于96孔細胞培養(yǎng)板中(5×103細胞/孔)，加入0.2 mL RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和1%鏈霉素。在含有5% CO2的37 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，每個孔中加入20 μL 5 mg/mL MTT PBS溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)3 h。隨后，移除含有MTT的培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO(二甲基亞砜)，在搖床上震蕩10 min，使用酶標儀測定每孔在490 nm處的吸光度值。使用不加藥物的細胞作為100%細胞生成率對照，使用不加MTT的細胞作為空白調(diào)零對照。所有組別試驗重復3次。每組細胞生存率(%)計算公式為(A樣品-A空白/A對照-A空白)×l00%，考察了不同濃度磁性普魯士藍納米粒子的細胞毒性。

1.2.8PBMNPs對腫瘤的磁靶向光熱治療效果

RPMI 1640培養(yǎng)基加入100 ppm PBMNPs與HeLa(人宮頸癌細胞)，在37 ℃孵育48 h。在培養(yǎng)過程中，將磁鐵放在培養(yǎng)皿的底部中間，通過磁場吸附磁性納米粒子30 min。然后采用波長為808 nm的激光器垂直照射6孔板底部10 min。最后細胞用PBS洗2遍，用鈣黃綠素染色，隨后用熒光顯微鏡成像。熒光顯微鏡下，活細胞為綠色，死細胞無色。試驗設置6個處理：1)無PBMNPs，無激光照射；2)無PBMNPs，激光照射；3)有PBMNPs，無激光照射；4)有PBMNPs，磁鐵吸附，無激光照射；5)有PBMNPs，無磁鐵吸附，激光照射；6)有PBMNPs，磁鐵吸附，有激光照射。每個處理三個平行，研究PBMNPs對腫瘤的磁靶向光熱治療效果。

2結果與討論

2.1Fe3O4MNPs和PBMNPs的圖片

本試驗以Fe3O4MNPs為核，在其表面包裹了一層普魯士藍納米殼，制備得到了PBMNPs。普魯士藍納米粒子的圖片如圖1所示。

圖1　Fe3O4MNPs和PBMNPs顯微圖片

由圖1可見，F(xiàn)e3O4MNPs呈球狀，大小均一，其平均粒徑約為18 nm。根據(jù)以往的文獻報道，F(xiàn)e3O4納米粒子的粒徑<20 nm時，其超順磁性良好，可以廣泛應用在磁靶向研究中。制備的PBMNPs結構和Fe3O4納米粒子結構不同，PBMNPs的外表具有一層殼狀結構。

2.2Fe3O4MNPs和PBMNPs的紅外光譜分析結果

Fe3O4MNPs和PBMNPs的紅外光譜圖如圖2所示。從Fe3O4MNPs的紅外光譜圖可以看出，604 cm-1是Fe-O的特征吸收峰，說明該物質(zhì)為Fe3O4MNPs；從PBMNPs的紅外光譜圖可以看出，604 cm-1處為Fe-O的特征吸收峰，2 084 cm-1為Fe3+-CN-Fe(II)橋式氰基伸縮振動吸收峰，說明在Fe3O4表面合成了PB納米粒子。試驗成功制備了具有核殼結構的磁性普魯士藍納米粒子。

圖2　制備的Fe3O4MNPs和PBMNPs的紅外光譜圖

2.3Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征試驗結果

Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁性表征試驗結果如圖3所示。

圖3　Fe3O4MNPs和PBMNPs的磁滯回線

圖3a和圖3b的曲線經(jīng)過原點(0,0)，說明Fe3O4MNPs和PBMNPs都具有超順磁性，在一定磁場作用下能夠發(fā)生定向移動；因此，PBMNPs可用于磁靶向光熱治療的研究。

2.4磁性普魯士藍納米粒子的近紅外光熱效應

近紅外光熱劑在近紅外激光的照射下，光熱劑會吸收近紅外光并可將其吸收的近紅外光轉換為熱量。100 ppm Fe3O4納米粒子、100 ppm普魯士藍和100 ppm PBMNPs水懸液在808 nm激光照射10 min中的溫度變化結果如圖4所示。

圖4　去離子水、Fe3O4NPs、PBNPs和PBMNPs　水懸液激光照射溫度變化

由圖4可知，100 ppm的Fe3O4NPs水懸液在激光照射10 min后，其溫度大約升高了5 ℃，變化不大。試驗結果說明，F(xiàn)e3O4NPs的近紅外光熱效應很弱，這主要因為Fe3O4NPs納米粒子在近紅外光區(qū)的光吸收較弱。100 ppm的PBNPs水懸液在激光照射的10 min中，溫度迅速上升，升至58.0 ℃，升溫速度較快。說明PBNPs的近紅外光熱效應較強。100ppm的PBMNPs水懸液在激光照射的10 min中，溫度也明顯升高，照射結束時，溫度達到了48.1 ℃，充分說明制備的PBMNPs光熱效應良好，這主要是因為普魯士藍納米殼的紅外光吸收效應良好。該PBMNPs水懸液照射約7 min，溫度就可由20 ℃升至42.6 ℃，超過了光熱殺死腫瘤細胞的溫度臨界值(42 ℃)。由于Fe3O4NPs的超順磁性良好，所以，PBMNPs將來在腫瘤的磁靶向光熱治療中應用前景良好。

2.5PBMNPs的近紅外光熱穩(wěn)定性

光熱穩(wěn)定性可以用來評價光熱劑性能，光熱穩(wěn)定性越高，其在癌癥光熱治療中的應用效果越好，因此，需要對PBMNPs進一步進行光熱穩(wěn)定性研究。試驗結果如圖5所示。由于PBMNPs具備良好的近紅外光熱效應，開啟激光器后，溫度迅速上升，照射10 min后，該PBMNPs水懸液的溫度由20 ℃上升至38.9 ℃。關閉激光器后，溫度開始慢慢自然下降。當降至初始溫度20 ℃時，再次開啟激光器，水懸液的溫度又開始上升，如此循環(huán)4次。

圖5　PBMNPs(100 ppm)水懸液激光照射　循環(huán)中的溫度變化

由圖5可知，該PBMNPs水懸液在這4個循環(huán)過程中的溫度變化十分穩(wěn)定，照射10 min后，4次的溫度分別升至39.8、39.6、39.7和39.9 ℃，說明PBMNPs的光熱穩(wěn)定性良好，在多次重復使用后，光熱效果穩(wěn)定。該PBMNPs的高光熱穩(wěn)定性主要是因為普魯士藍納米殼的結構穩(wěn)定性較高[2]。

2.6細胞毒性試驗結果

PBMNPs的細胞毒性試驗結果如圖6所示。靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)與PBMNPs孵育，表現(xiàn)出與劑量相關的細胞毒性，PBMNPs濃度<500 ppm，細胞存活率均>90%，表明PBMNPs對HUVEC細胞生長沒有明顯的影響(P>0.05)。上述結果表明，該PBMNPs對HUVEC細胞的細胞毒性較小，因此具有較好的細胞相容性。因為普魯士藍是一種臨床用藥，所以，它的生物相容性較高；同時，F(xiàn)e3O4NPs在臨床中也得到了應用，因此它的生物相容性也較好。正是因為二者的生物相容性良好，導致PBMNPs也具有良好的細胞相容性。

圖6　PBMNPs的細胞毒性試驗(P<0.05)

2.7PBMNPs對腫瘤的磁靶向光熱治療效果

利用磁性納米粒子的流動性和磁性，在外加磁場的控制下，在特定的靶向部位進行富集，發(fā)揮定向優(yōu)勢。在用鈣黃綠素進行雙染后用熒光顯微鏡成像，活細胞顯示綠色，試驗結果如圖7所示。

圖7　人宮頸癌細胞(HeLa)經(jīng)不同處理后的鈣黃綠素　染色熒光顯微鏡圖片

從圖7可以看出：處理a～c中，HeLa細胞熒光全部為綠色，表明HeLa細胞全部存活。處理b中，在磁鐵吸附PBMNPs的情況下，HeLa細胞存活，說明磁鐵吸附磁性納米粒子本身不會造成腫瘤細胞死亡。處理c說明，存在PBMNPs時，無磁鐵吸附，激光照射不會造成HeLa細胞死亡。處理d中，在激光照射前，將磁鐵在6孔板底部放置30 min，再用激光照射10 min，熒光顯微鏡圖片中出現(xiàn)了一塊黑色區(qū)域，該區(qū)域和激光的照射區(qū)域相同，周圍HeLa細胞存活，激光照射區(qū)域的HeLa細胞死亡。由于納米離子具有一定的磁性，可在磁場中定向移動，因此該PBMNPs可在磁場的作用下，定位至6孔板底部，分散于生長在板底的HeLa細胞表面，提高了納米離子的作用濃度，納米粒子吸收光能轉化成熱能，提高了對腫瘤細胞的光熱切除效果。

3結語

本文研究的是基于PBMNPs的靶向診療一體化，試驗結果表明，PBMNPs能夠提高腫瘤的光熱治療效果，對其進行深入研究，可以挖掘其在腫瘤臨床治療中的巨大作用，發(fā)揮其重要價值。

參考文獻

[1] Xu C J, Wang B D, Sun S H. Dumbbell-like Au-Fe3O4nanop-articles for target-specific platin delivery[J]．J Am Chem Soc, 2009, 131(12):4216-4217.

[2] 周鳴宇,梁小蕊,吳世永,等.試驗條件對氧化鋅納米材料形貌的影響[J]. 新技術新工藝，2013(12)：111-113.

責任編輯鄭練

Research on the Diagnosis and Treatment of Targeting Prussian Blue Nano Particles

YIN Xiang, FEI Haihang

(Equipment Department, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China)

Abstract:In recent years, the treatment of tumors by using the photothermal effect of nano materials has become a focus in medical research. In the paper, PBMNPs were prepared and its infrared spectrum, paramagnetism, near-infrared photothermal effect, near-infrared photothermal stability had been researched. The photothermal effect in magnetic targeting tumor treatment and the cytotoxicity of PBMNPs were also analyzed.

Key words:Prussian blue, photothermal therapy, magnetic targeting

收稿日期：2015-01-05

作者簡介：尹翔(1981-)，男，工程師，主要從事醫(yī)療設備儀器等方面的研究。

中圖分類號：R 730.54

文獻標志碼：A