黃曲霉毒素B1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和空腸消化酶活性的影響

李建功 陳代文 余 冰 何 軍 毛湘冰 虞 潔 鄭 萍王曲圓 王慧芬 曾 珠 羅鈞秋

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，雅安 625014)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是一類由黃曲霉和寄生曲霉等產(chǎn)毒真菌通過(guò)聚酮途徑所產(chǎn)生的一類真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，在1961年英國(guó)發(fā)生的10萬(wàn)只火雞突發(fā)性死亡事件首次被發(fā)現(xiàn)［1］。隨著對(duì)AF的深入研究發(fā)現(xiàn)，AF尤其是黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)具有很強(qiáng)致癌和致畸作用。AFB1在機(jī)體內(nèi)代謝主要經(jīng)腸道吸收，在肝臟內(nèi)經(jīng)羥基化、去甲基和環(huán)氧化作用后發(fā)揮其基因毒性和細(xì)胞毒性。大量研究證實(shí)AFB1可通過(guò)降低肝臟抗氧化水平，誘發(fā)氧化應(yīng)激，抑制免疫系統(tǒng)激活，降低動(dòng)物采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率，影響動(dòng)物生長(zhǎng)性能［2］。腸道作為最早接觸毒素的部位，同時(shí)作為消化吸收的主要場(chǎng)所，與動(dòng)物的生長(zhǎng)性能存在直接關(guān)系，但目前AFB1對(duì)斷奶仔豬腸道消化吸收功能的研究尚不明朗。因此，本試驗(yàn)旨在以斷奶仔豬為模型，通過(guò)在霉變飼糧中添加外源性AFB1，研究以AFB1為主的作用因素對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能和空腸消化酶活性的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)吸附劑的吸附效果，為其在生產(chǎn)實(shí)踐中的推廣應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

AFB1吸附劑主要成分為蒙脫石。

飼糧中AFB1來(lái)源于低含量的霉變玉米和本實(shí)驗(yàn)室利用產(chǎn)毒菌株通過(guò)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵而來(lái)。經(jīng)檢測(cè)，AFB1組和AFB1+吸附劑組AFB1含量分別為288和290μg/kg。

AFB1含量采用GB/T 17480—2008中的酶聯(lián)免疫法(ELISA)測(cè)得［3］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用2×2因子設(shè)計(jì)，分為4個(gè)組。選取28日齡的“杜×長(zhǎng)×大”三元雜交斷奶仔豬72頭，依體重相近、公母各占1/2的原則，分為對(duì)照組(基礎(chǔ)飼糧)、吸附劑組(基礎(chǔ)飼糧+0.25%吸附劑)、AFB1組(霉變玉米飼糧，AFB1預(yù)期含量為300μg/kg)和AFB1+吸附劑組(霉變玉米飼糧+0.25%吸附劑)，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭仔豬，試驗(yàn)期35 d，于試驗(yàn)第22～28天進(jìn)行消化代謝試驗(yàn)。霉變玉米飼糧為霉變玉米100%替代基礎(chǔ)飼糧中正常玉米的飼糧。

1.3 基礎(chǔ)飼糧

基礎(chǔ)飼糧營(yíng)養(yǎng)水平參照NRC(2012)仔豬營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼糧形態(tài)為粉料。

1.4 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)管理在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行。試驗(yàn)期間，溫濕度適宜，自由采食、飲水，日喂 4 次(08:00、12:00、16:00、20:00)，每次喂料量以飽食后料槽內(nèi)略有剩余為度，每天詳細(xì)記錄各圈豬的采食量，其余管理按常規(guī)進(jìn)行。分別于試驗(yàn)的第15天和試驗(yàn)結(jié)束日早上空腹稱重。于試驗(yàn)期第22～28天進(jìn)行消化試驗(yàn)。

1.5 樣品采集與處理

血樣:試驗(yàn)第36天08:00，對(duì)空腹12 h的試驗(yàn)豬只進(jìn)行空腹稱重后，每重復(fù)選1頭接近平均體重的仔豬，前腔靜脈采血10 m L，靜置30 m in后，3 000 r/m in離心10 m in，分離血清，－20℃保存待測(cè)。

組織樣品:豬只采血完畢后，耳緣靜脈注射鹽酸－氯丙嗪(3 mg/kg BW)麻醉處死，打開(kāi)腹腔，分離肝臟和空腸，迅速采集肝臟左葉部分樣品固定于10%福爾馬林溶液中，用于制作病理切片。取空腸中段刮取黏膜，裝于凍存管內(nèi)，－70℃保存待測(cè)。

糞樣收集:采用部分收糞法連續(xù)收集4 d的糞樣。每天結(jié)束后將收集的糞樣稱重，按每100 g加10%H2SO45 m L進(jìn)行固氮處理，數(shù)滴甲苯防腐，混勻糞樣，置于－20℃的冰箱中。試驗(yàn)期結(jié)束后，將4 d收集到同一重復(fù)豬的糞樣混勻，烘干、粉碎、過(guò)篩，制得風(fēng)干樣，－20℃保存。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.1 生長(zhǎng)性能

于試驗(yàn)起始和結(jié)束時(shí)08:00空腹稱重，計(jì)算平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.6.2 養(yǎng)分表觀消化率

采用內(nèi)源性指示劑測(cè)定飼糧常規(guī)養(yǎng)分表觀消化率。飼糧和糞樣的粗灰分(ash)、粗蛋白質(zhì)(CP)、消化能(DE)、鈣(Ca)和磷(P)含量的測(cè)定參照張麗英［4］主編的《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》中的常規(guī)方法進(jìn)行，內(nèi)源性指示劑含量采用GB/T 23742—2009［5］方法測(cè)定。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

續(xù)表1

1.6.3 肝臟組織病理變化

對(duì)固定于10%甲醛固定液中的肝臟組織塊經(jīng)修理、包埋、切片等處理，制成6μm的切片，蘇木精－伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.6.4 血清生化指標(biāo)

血清總蛋白(total protein，TP)、白蛋白(album in，ALB)、和尿素氮(urea nitrogen，UN)含量采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定，然后計(jì)算球蛋白(globulin，GLB)含量，計(jì)算公式如下:

GLB=TP－ALB。

1.6.5 空腸黏膜消化酶活性

二糖酶:蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶的活性采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

寡肽酶:羧肽酶A(carboxypeptidase A，CPA)、二肽基肽酶Ⅳ(dipeptidyl peptidase，DPP-Ⅳ)、氨肽酶(am inopeptidase，APN)、γ－谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γglutamyltransferase，GGT)活性采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定，試劑盒來(lái)自Rapidbio Biosource R＆D(美國(guó))。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010整理，以重復(fù)為單位統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)軟件中的一般線性模型(GLM)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行2×2兩因子方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，模型主效應(yīng)包括AFB1(0或300 μg/kg)、吸附劑(0或 0.25%)以及二者之間的互作，以P＜0.05為差異顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬ADG、ADFI和 F/G 無(wú)顯著影響(P＞0.05)，且二者無(wú)顯著交互作用(P＞0.05)。

2.2 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表3可知，AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬飼糧CP、ash、DE、P和Ca的表觀消化率無(wú)顯著影響(P＞0.05)，且二者對(duì) CP、ash、DE、P 的表觀消化率無(wú)顯著的交互作用(P＞0.05)，對(duì)Ca的表觀消化率有交互作用的趨勢(shì)(P=0.05)。

2.3 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬血清TP、ALB、GLB和 UN含量無(wú)顯著影響(P＞0.05)，且二者無(wú)顯著交互作用(P＞0.05)。

2.4 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，對(duì)照組和吸附劑組斷奶仔豬肝臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝索和肝竇均較清晰，而AFB1組肝細(xì)胞腫脹，肝索排列紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，胞漿內(nèi)見(jiàn)有形態(tài)不規(guī)則的空泡。AFB1+吸附劑組病變程度相對(duì)較輕，肝組織病理學(xué)變化主要以肝細(xì)胞輕度萎縮，肝細(xì)胞以顆粒變性為主。

表2 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of AFB1 and adsorbent on grow th performance of weaned piglets

表3 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響Table 3 Effects of AFB1 and adsorbent on nutrient apparent digestibility of weaned piglets

表4 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of AFB1 and adsorbent on serum biochem ical parameters of weaned piglets

2.5 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬空腸消化酶活性的影響

由表5可知，AFB1對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜二糖酶和寡肽酶活性影響不顯著(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，吸附劑顯著降低了蔗糖酶和乳糖酶的活性(P＜0.05)，對(duì)麥芽糖酶活性有降低的趨勢(shì)(P=0.07)。AFB1和吸附劑二者對(duì)2類消化酶活性的影響均無(wú)顯著交互作用(P＞0.05)。

3 討論

3.1 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

AFB1作為一種劇毒物質(zhì)，高劑量極易造成死亡，低劑量則會(huì)由于累積效應(yīng)導(dǎo)致動(dòng)物慢性中毒［2］。雖然AFB1在各年全國(guó)飼料抽檢中均有發(fā)現(xiàn)，但含量總體不高，因此在生產(chǎn)中多表現(xiàn)慢性中毒現(xiàn)象。于會(huì)民等［6］研究報(bào)道，斷奶仔豬飼糧中添加 100μg/kg的 AFB1，飼喂 30 d后，ADG和ADFI下降了 6.41%和 3.45%。史瑩華等［7］報(bào)道，AF能顯著降低豬的生長(zhǎng)性能，ADG降低了12.90%，F(xiàn)/G 升高了 7.54%。張玲等［8］用 AFB1含量216μg/kg的自然霉變玉米代替正常玉米飼喂斷奶仔豬21 d后也發(fā)現(xiàn)，自然霉變組豬只的ADG和ADFI均顯著降低。本研究采用AFB1300μg/kg劑量，屬于中低劑量水平，試驗(yàn)結(jié)果表明，AFB1組仔豬ADG和ADFI分別降低了5.75%和4.93%，F(xiàn)/G無(wú)顯著變化。添加吸附劑后仔豬ADG 和 ADFI提高了 3.00%和 4.00%，這與前人研究結(jié)果一致，說(shuō)明AFB1可能會(huì)通過(guò)抑制仔豬的ADFI降低 ADG，從而影響生長(zhǎng)性能。雷曉婭［9］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFB1霉變飼糧可通過(guò)降低采食量抑制生長(zhǎng)，并且在相同采食水平下，AFB1霉變飼糧與正常飼糧組相比，可改善仔豬的生長(zhǎng)效應(yīng)。當(dāng)添加AFB1吸附劑后，由于對(duì)毒素的吸附作用，一定程度上減緩了AFB1進(jìn)入機(jī)體的速度，從而在ADG和ADFI略有改善。

圖1 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of AFB1 and adsorbent on the organizational structure of liver of weaned piglets

3.2 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血清TP、ALB、GLB和UN含量可在一定程度上反映動(dòng)物肝臟和腎臟的健康狀態(tài)。Denli等［10］在肉雞飼糧中添加1 mg/kg的AFB1可顯著降低血清TP和ALB的含量。Marin等［11］研究發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬飼糧中添加140、280μg/kg AFB1后，血清TP、ALB和GLB含量并沒(méi)有發(fā)生顯著性改變。姚麗欣［12］在育肥豬飼糧中添加 300、600μg/kg的AFB1飼喂10周后發(fā)現(xiàn)，各組和各時(shí)間段豬血清UN的含量均無(wú)顯著性變化。Lindemann 等［13］和 Harvey 等［14］在育肥豬飼糧中分別添加2 500和800μg/kg的AFB1也發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組血清中的UN含量無(wú)顯著變化。上述各位作者的結(jié)論與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致，說(shuō)明AFB1在低劑量和短期時(shí)間內(nèi)，對(duì)機(jī)體蛋白質(zhì)合成代謝影響不顯著，其原因可能是斷奶仔豬肝臟組織細(xì)胞較強(qiáng)的再生功能，使得雖然有一部分肝臟細(xì)胞發(fā)生病變但肝臟總的的合成代謝功能影響不顯著。

表5 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬空腸消化酶活性的影響Table 5 Effects of AFB1 and adsorbent on the jejunum activities of digestive enzymes of weaned piglets

3.3 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

肝臟作為動(dòng)物機(jī)體主要的代謝器官，具有很強(qiáng)的生物轉(zhuǎn)化功能和解毒功能，也是AFB1進(jìn)入機(jī)體后攻擊的主要器官。AFB1進(jìn)入機(jī)體后形成的高活性分子形式AFB1-exo-8，9－環(huán)氧化合物，極易以共價(jià)鍵與酶蛋白分子結(jié)合，使酶蛋白失活，降低肝臟抗氧化酶活性，導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量的自由基和活性氧，破壞氧化－應(yīng)激系統(tǒng)，引發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)而造成肝臟損傷，嚴(yán)重的會(huì)引發(fā)原發(fā)性肝癌。有研究表明，AFB1高污染地區(qū)肝癌的發(fā)生過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族的Survivin mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，而Survivin可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡等途徑引發(fā)肝癌［15］。史瑩華等［7］等在生長(zhǎng)肥育豬飼糧中添加100μg/kg的AFB1后，過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性顯著降低。呂武興等［16］在飼糧中添加AFB1純品飼喂肉鴨后發(fā)現(xiàn)，低劑量AFB1導(dǎo)致肝小葉形態(tài)模糊，少量肝細(xì)胞壞死;高劑量AFB1導(dǎo)致肝組織出現(xiàn)大量的顆粒變性和水泡變性，同時(shí)伴有纖維結(jié)蹄組織增生和膽管增生。本研究室張玲等［8］研究也表明，AFB1組仔豬肝臟總抗氧化能力降低15%，丙二醛含量增加7.4%，同時(shí)肝臟病理切片顯示肝索排列紊亂，肝細(xì)胞質(zhì)溶解、消失，細(xì)胞核固縮或消失，肝細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的顆粒變性和空泡變性，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致，說(shuō)明AFB1造成了斷奶仔豬肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)的損傷。

3.4 AFB1及其吸附劑對(duì)斷奶仔豬飼糧養(yǎng)分表觀消化率和空腸消化酶活性的影響

小腸黏膜不僅是機(jī)體消化吸收養(yǎng)分的場(chǎng)所，也是抵御外界致病微生物和毒素入侵的最后一道防線，其健康狀態(tài)與養(yǎng)分消化吸收緊密相關(guān)。研究表明飼糧中的霉菌毒素能破壞豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，如腸絨毛變短、隱窩變深、黏膜厚度減少，此種損傷可能導(dǎo)致養(yǎng)分吸收不良。目前在仔豬上關(guān)于AFB1影響表觀消化率和消化吸收方面的報(bào)道很少，但從家禽的研究報(bào)道來(lái)看，攝食AFB1后，在一定程度上會(huì)降低動(dòng)物的消化吸收功能。Verma等［17］研究發(fā)現(xiàn)肉鴨飼喂含AF 2 mg/kg的飼糧代謝能顯著下降，TP的利用率降低了50.97%，同時(shí)對(duì)CP凈利用率隨AF添加量的增多而下降。Ostrowski-Meissner等［18］研究發(fā)現(xiàn)污染了AF的飼糧會(huì)造成肉鴨氮沉積和血漿總氨基酸含量降低，回腸消化率降低。當(dāng)飼糧AF達(dá)到210μg/kg時(shí)，會(huì)降低CP利用率。上述研究表明，動(dòng)物攝入AFB1后，能影響飼料的利用率，降低養(yǎng)分尤其是CP利用率。馮光德等［19］在肉鴨飼糧中添加AFB1后發(fā)現(xiàn)，霉變組的空腸黏膜堿性磷酸酶、麥芽糖酶、蔗糖酶活性與對(duì)照組相比都有所升高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AFB1組與對(duì)照組相比，養(yǎng)分表觀消化率變化不顯著，二糖酶活性均有所降低，這與以上結(jié)果不一致。這可能是由于AFB1的添加劑量、物種耐受程度和作用時(shí)間的差異，也有可能是全身代謝和激素分泌異常引起的［20－21］。Applegate 等［22］等在肉雞飼糧中添加 0.6、1.2 和 2.5 mg/kg AFB1時(shí)，中等劑量組麥芽糖酶的活性增加，最高劑量組麥芽糖酶的活性降低，3個(gè)組對(duì)干物質(zhì)和氮的利用率無(wú)顯著影響。添加吸附劑后，二糖酶活性沒(méi)有顯著地改善，原因可能是吸附劑除了能夠吸附毒素外，還會(huì)吸附相應(yīng)的養(yǎng)分，尤其是水分和纖維，這二者是維持胃腸排空關(guān)鍵的養(yǎng)分。同時(shí)吸附劑的吸附效應(yīng)是一個(gè)吸附—解析的動(dòng)態(tài)過(guò)程，當(dāng)胃腸排空速度減慢，意味毒素與腸道黏膜的接觸時(shí)間相對(duì)增加。

4 結(jié)論

飼糧中AFB1超標(biāo)(AFB1含量290μg/kg)可顯著降低斷奶仔豬仔豬空腸消化酶活性，導(dǎo)致肝臟出現(xiàn)組織病變，一定程度的降低斷奶仔豬生長(zhǎng)性能;添加吸附劑后可在一定程度上緩解AFB1造成的肝臟毒性和對(duì)生長(zhǎng)性能的負(fù)面影響。

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