低溫體外保存對血小板活化和凋亡的影響

劉立坤，高會霞，李永乾

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院輸血科，河北 石家莊050051；2.河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗科，河北 石家莊050021）

目前，標(biāo)準(zhǔn)的血小板保存條件只有常溫（22±2）℃振蕩保存和二甲亞砜冷凍保存，儲存不足限制了血小板臨床應(yīng)用。有體外實驗證明，室溫中保存的血小板容易失去止血功能［1］。血小板在保存期內(nèi)的活化和凋亡可能是導(dǎo)致血小板功能降低，影響血小板輸注效果的重要因素。因此，保護血小板活性、提高其體外的存活率是血小板保存面臨的重要問題。本研究將血小板在不同的溫度下懸浮于添加液與血漿的混合液中，觀察其保存期內(nèi)的活化和凋亡情況，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器 血小板添加液成分：海藻糖75.00g／L、Na2HPO43.05g／L、KCl 0.37g／L、NaH2PO4·2H2O 1.05g／L、NaCl 4.05g／L、MgCl2·6H2O 0.30g／L、Na3枸櫞酸·2H2O 3.18 g／L［2］；血細(xì)胞計數(shù)儀（日本Sysmex公司）；流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 血小板的制備及保存 取20份單采血小板，每份均一分為三，一份貯存于（22±2）℃振蕩器（對照組），其余二份離心（1 000g，10min），保留35%血漿，加入65%的血小板添加液混勻，分別保存于10℃靜置冷藏（實驗Ⅰ組）及（22±2）℃振蕩儀（實驗Ⅱ組）。

1.3 血小板質(zhì)量評價指標(biāo)的檢測 血細(xì)胞計數(shù)儀測定血小板計數(shù)（platelet count，PLT）；流式細(xì)胞儀檢測血小板CD62p和△Ψm［3］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

隨著時間延長，3組PLT比較平穩(wěn)，在組間、時點間以及組間·時點間交互作用差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；隨著時間延長CD62p逐漸升高，而△Ψm%逐漸下降，3組CD62p、△Ψm在組間、時點間以及組間·時點間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1～3。

表1 3組PLT不同保存時間檢測結(jié)果比較Table 1 PLT＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

表1 3組PLT不同保存時間檢測結(jié)果比較Table 1 PLT＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

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表2 3組CD62P不同保存時間檢測結(jié)果比較Table 2 CD62P＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

表2 3組CD62P不同保存時間檢測結(jié)果比較Table 2 CD62P＇s results of three groups in different preservation time（n=20，±s）

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表3 3組△Ψm不同保存時間檢測結(jié)果比較Table 3 △Ψm＇s results of three groups in different preservation time（n=20±s）

表3 3組△Ψm不同保存時間檢測結(jié)果比較Table 3 △Ψm＇s results of three groups in different preservation time（n=20±s）

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3 討 論

血小板是人體凝血機制中重要的血液成分，其體積小，無細(xì)胞核，但卻存在明顯的凋亡現(xiàn)象，影響輸注后體內(nèi)的存活率［4］。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定懸浮在自體血漿的單采血小板在（22±2）℃振蕩保存僅有5d的有效期，造成臨床供應(yīng)不足。現(xiàn)在面臨的難題是血小板的保存時間越長越容易發(fā)生血小板的儲存損傷，血小板不斷激活，釋放一系列炎性因子，并引起血小板凋亡，其功能和體內(nèi)存活率大大降低，影響臨床治療效果，甚至輸注無效［1］。

血小板在活化時可分泌和表達一系列特異性蛋白，特別是血小板膜表面糖蛋白CD62p，它是血小板a顆粒膜蛋白，在靜息血小板中CD62p僅分布于a顆粒膜上，血小板活化時a顆粒膜蛋白快速與質(zhì)膜融合并在血小板表面持久表達，與中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和單核細(xì)胞膜上的CD62p糖蛋白配體1結(jié)合，驅(qū)動淋巴細(xì)胞亞群的遷移與錨定，它是目前最具特性的血小板活化分子標(biāo)志物［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，血小板膜表面糖蛋白CD62p的高表達可能與血小板在體內(nèi)循環(huán)中被快速清除有關(guān)［5］。Holme等［6］認(rèn)為CD62P表達＜30%時血小板體內(nèi)活力較好，CD62p表達＞60%時其體內(nèi)活力極低。本研究觀察到：3組CD62p表達率都是隨著時間的延長逐漸增加，1～3d時實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的CD62p表達率與對照組差別不大，而5～7d時對照組CD62p表達最低，實驗Ⅰ組次之，實驗Ⅱ組最大（但3組CD62p表達率均＜60%），這提示血小板懸浮在血小板添加液比懸浮于自身血漿中可能更容易激活，其原因目前尚不清楚，推測可能與血漿中含有激活抑制因子有關(guān)［7］；但在相同血小板添加液中貯存血小板的實驗Ⅰ組（10℃）CD62p表達率低于實驗Ⅱ組（22℃），說明低溫保存對血小板的活化有保護作用。血小板保存期間不僅CD62p表達增加，而且還會釋放一些細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子B1、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1B等，這些細(xì)胞因子可能導(dǎo)致無抗體調(diào)節(jié)的輸血反應(yīng)［8］。單采血小板的活化程度和保存期間細(xì)胞因子的釋放是由血小板添加液的性質(zhì)和保存溫度等綜合因素決定的［7］。本研究用65%血小板添加液混合35%血漿來保存血小板，觀察7 d內(nèi)血小板的體外功能。血小板添加液中海藻糖能很好地抑制寒冷導(dǎo)致的血小板變形聚集，是一種非常有研究潛力的低溫血小板保護劑［9］，少量的血漿可以提供血小板代謝所需要的底物。用血小板添加液混合血漿保存血小板，可以降低血漿使用比例，還可以降低血液傳染病毒和其他病原體的可能，但對血小板的激活抑制作用稍差于血漿保存的對照組，在這方面仍有待于研究改進。

細(xì)胞凋亡又稱為細(xì)胞程序性死亡，是一種主動的、程序性的由基因控制的細(xì)胞自主性死亡方式。越來越多的證據(jù)表明，線粒體是凋亡的執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡調(diào)控的活動中心，所以線粒體是參與細(xì)胞凋亡過程的一種重要細(xì)胞器，線粒體外膜的高通透性使得線粒體內(nèi)外膜間隙內(nèi)的環(huán)境與胞質(zhì)中的環(huán)境幾乎相似。與外膜不同的是，其內(nèi)膜的蛋白質(zhì)／脂質(zhì)比較高，心磷脂的含量同樣較高，但膽固醇及其缺乏，這就形成了線粒體內(nèi)膜對離子的不可滲透性，即內(nèi)膜通透性屏障（不能通過相對分子質(zhì)量＞15 000的物質(zhì)）。在氧化呼吸過程中線粒體形成橫跨線粒體內(nèi)膜的跨膜電位△Ψm，而△Ψm的變化與細(xì)胞線粒體內(nèi)膜通透性密切相關(guān)。有研究報道許多生理或非生理因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡均存在△Ψm降低，凋亡可能是導(dǎo)致庫存血小板失活的重要因素，而溫度又是血小板凋亡的影響因素［3］。線粒體△Ψm去極化是血小板凋亡的早期表現(xiàn)和特征性改變。本研究分別在10℃及22℃左右的溫度保存血小板7d，觀察△Ψm去極化的情況，試圖揭示低溫對血小板凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著儲存時間的延長，血小板的早期凋亡率顯著增加。實驗Ⅰ組與實驗Ⅱ組的保存液相同，但溫度有所不同，與實驗Ⅱ組［（22±2）℃］相比，實驗Ⅰ組（10℃）儲存的血小板的凋亡程度最低，表明10℃低溫對血小板起到了很好的保護作用。

本研究初步揭示了血小板在血小板添加液及低溫條件下體外保存時的活化和凋亡情況，為選擇合適的血小板保存液和保存溫度提供了初步依據(jù)，隨著血小板保護劑和保存條件的深入研究，將會更加有效地抑制血小板的活化和凋亡，血小板的保存時間將會有效延長。

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