間歇性變應(yīng)性鼻炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和白細(xì)胞介素17的變化

李保衛(wèi)，石小偉，吳 瑋＊，徐冰心，丁瑞英，范日升

（1.中國人民解放軍第306醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京100101；2.福建醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，

福建 泉州362000；3.中國人民解放軍第306醫(yī)院中心實驗室，北京100101；4.中國人民解放軍63710部隊衛(wèi)生處，山西 忻州136200）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是發(fā)生在鼻腔黏膜的變態(tài)反應(yīng)性疾病，對患者生活質(zhì)量有嚴(yán)重影響。關(guān)于AR發(fā)病的免疫機(jī)制目前尚未完全明確。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）和輔助性T細(xì)胞17（T help cell 17，Th17）是近年發(fā)現(xiàn)的新的CD4＋T細(xì)胞亞群，前者因細(xì)胞表面表達(dá)白細(xì)胞介素2受體α鏈（即 CD25），被命名為 Treg［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能與哮喘發(fā)病相關(guān)［2］，但其與AR的關(guān)系仍不明確。CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子是叉頭／翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（forkhead box protein-3，F(xiàn)oxp3）［3］。Th17 以 產(chǎn) 生 的 白 細(xì) 胞 介 素 17（interleukin-17，IL-17）為其特征性因子［4］。目前研究表明，Th17細(xì)胞亞群可能在炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［5］。本研究通過觀察間歇性變應(yīng)性鼻炎（intermittent allergic rhinitis，IAR）患者間歇期、發(fā)作期前（發(fā)作期前2周）、發(fā)作期及對照組外周血中Treg和IL-17的變化，探討二者在IAR發(fā)病中的作用。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年3—11月我軍某部某基地資料完整的IAR患者19例，男性18例，女性1例，年齡22～48歲，平均（32.5±6.4）歲，均符合 AR診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；另選擇同期當(dāng)?shù)刂驹刚邽閷φ战M共27例，男性20例，女性7例，年齡22～33歲，平均（26.5±3.8）歲。對所有研究對象進(jìn)行詳細(xì)的病史采集以及?？撇轶w，并進(jìn)行皮膚點刺試驗，排除哮喘和特異性皮炎等其他變態(tài)反應(yīng)性疾病、鼻息肉等鼻部疾病以及全身其他疾病，且患者2周內(nèi)未使用皮質(zhì)激素或抗組胺藥?；颊呒皩φ战M均征得本人同意，并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器 試劑：變應(yīng)原點刺試劑（阿羅格）；小鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、小鼠抗人CD4-APC單克隆抗體、小鼠抗人CD25-APC單克隆抗體、小鼠抗人IL-17A-PE單克隆抗體（美國BD公司）；小鼠抗人Foxp3-PE單克隆抗體、大鼠抗人IgG2α-PE、固定／破膜濃縮劑、固定／破膜稀釋液、破膜稀釋用BUFFER（E-Biosciences公司）。儀器：流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）；離心機(jī)（德國KENDRO公司）；渦旋混勻器（IKA公司）。

1.3 實驗方法 分別在間歇期、發(fā)作期前及發(fā)作期3個階段于清晨空腹采取靜脈血2mL，對照組同樣條件下一次性分別各采取靜脈血2mL，肝素鈉抗凝，放置于4℃環(huán)境，4h內(nèi)檢測。檢測前先配制稀釋破膜液與緩沖液，在流式管中加入100μL外周全血及CD4-FITC 10μL及CD25-APC 2.5μL，室溫避光15min后加稀釋破膜液1mL／管，混勻后4℃避光30min。離心后棄上清，每管中加入緩沖液1.5mL洗滌，分別加入2.5μL FOXP3-PE、5μL IL-17A-PE標(biāo)記的抗體后4℃下避光30min。再次洗滌后予PBS稀釋，用4%多聚甲醛固定?；靹蚝?℃避光保存，上流式細(xì)胞儀。用BD FACSDiva軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細(xì)胞、CD4＋I(xiàn)L-17＋T淋巴細(xì)胞在CD4＋T淋巴細(xì)胞中的百分比表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

IAR患者外周血中Treg和IL-17占外周血中CD4＋T淋巴細(xì)胞的比例從間歇期至發(fā)作期逐步升高。IAR患者Treg均低于對照組（P＜0.05），間歇期、發(fā)作前期、發(fā)作期間Treg雖呈增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。IL-17在間歇期低于對照組（P＜0.05），在發(fā)作期高于對照組（P＜0.05），從間歇期、發(fā)作期前至發(fā)作期IL-17明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Treg／Th17從間歇期至發(fā)作期下降，間歇期與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但發(fā)作期前、發(fā)作期與對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Treg／Th17發(fā)作期前、發(fā)作期與間歇期相比下降明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），發(fā)作期較發(fā)作期前亦下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 變應(yīng)性鼻炎患者不同時期外周血中的Treg、IL-17比較Table 1 Changes of CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg and IL-17at different periods in peripheral blood of patients with intermittent allergic rhinitis(±s）

表1 變應(yīng)性鼻炎患者不同時期外周血中的Treg、IL-17比較Table 1 Changes of CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg and IL-17at different periods in peripheral blood of patients with intermittent allergic rhinitis(±s）

＊P＜0.05與對照組比較 ＃P＜0.05與IAR間歇期比較 ☆P＜0.05與IAR發(fā)作期前比較（q檢驗）

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3 討 論

AR是指特應(yīng)性個體在接觸特異性變應(yīng)原后發(fā)生的主要由IgE介導(dǎo)的組織胺、白三烯等引起的炎性介質(zhì)的釋放，并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的鼻黏膜炎癥性疾病。目前的研究認(rèn)為Thl細(xì)胞與Th2細(xì)胞的免疫失衡促進(jìn)AR的發(fā)生，向Th2細(xì)胞過度分化是導(dǎo)致AR的重要原因［7］。Treg細(xì)胞對二者均有抑制作用。Treg來源于CD4＋T細(xì)胞，占其比例的5%～10%，并且持續(xù)高表達(dá)IL-2受體α鏈（CD25），被稱為CD4＋CD25＋T細(xì)胞亞群，其數(shù)量的減少、表面分子表達(dá)的缺陷、抑制功能受損，均可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。Th17細(xì)胞作為一種新的輔助性T細(xì)胞亞群，產(chǎn)生的最重要的效應(yīng)因子是IL-17，可與人IL-17R結(jié)合而發(fā)揮效應(yīng)。目前的文獻(xiàn)報道多認(rèn)為IL-17為前炎癥因子，可能對變應(yīng)性炎癥的發(fā)病起促進(jìn)作用［8-10］。當(dāng)機(jī)體處于不同的狀態(tài)時，Th17細(xì)胞與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間能夠相互作用，以維持機(jī)體狀態(tài)的平衡。在AR的發(fā)病中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與Th17細(xì)胞的作用及其作用機(jī)制仍未完全明確。

目前Treg與AR關(guān)系的研究較多。Lee等［11］研究發(fā)現(xiàn)AR患者Foxp3mRNA較對照組表達(dá)下降。而 Han等［12］研究表明，與對照相比，CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)在持續(xù)性AR患者體內(nèi)無變化。另有研究發(fā)現(xiàn)，AR患者在經(jīng)過特異性免疫治療后體內(nèi)Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量上升［13］。由此可見，Treg在AR中的作用仍不明確。本研究結(jié)果顯示，IAR患者無論發(fā)病與否，體內(nèi)CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細(xì)胞水平均較對照組有所下降。表明Treg數(shù)量不足，AR的發(fā)病可能與Treg數(shù)量下降有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在空氣中花粉含量高的季節(jié)，過敏性疾病患者體內(nèi)Treg的抑制活性喪失，促進(jìn)過敏性疾病的急性發(fā)作和發(fā)展，而沒有花粉的季節(jié)里，不論是否患過敏性疾病，體內(nèi)Treg都能發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，從而抑制Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生［10］。而Treg的下調(diào)，可能打破Th1／Th2的平衡，表現(xiàn)為Th2功能增強。本研究結(jié)果顯示，在IAR的不同時期，體內(nèi)CD4＋CD25＋Foxp3＋T淋巴細(xì)胞水平不同，發(fā)作期明顯升高。這表明AR患者體內(nèi)的Treg存在缺陷，而且該細(xì)胞亞群的缺陷可能是特應(yīng)性體質(zhì)的特征，或者與機(jī)體的疾病狀態(tài)或者說過敏癥狀無關(guān)。

目前關(guān)于IL-17在AR中的表達(dá)尚存在爭議。Ciprandi等［14］首先檢測了樺樹過敏的AR患者血清中IL-17水平較對照組升高，進(jìn)行舌下含服免疫治療后，癥狀最嚴(yán)重的AR患者尚能檢測到IL-17。Lu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，AR患者鼻黏膜和外周血中RORγtmRNA的相對表達(dá)量及IL-17水平高于對照組，且與鼻過敏癥狀評分呈正相關(guān)。Qu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，AR患者的外周血單個核細(xì)胞中的Th17比例、RORγtmRNA表達(dá)水平較對照組升高，細(xì)胞因子IL-17、IL-6及IL-23亦較對照組增加，經(jīng)1年特異性免疫治療后上述檢測指標(biāo)有所下降。而Klemens等［17］將AR與病毒性鼻炎對比研究中發(fā)現(xiàn)，只有后者鼻腔分泌物中的IL-17表達(dá)水平升高。本研究結(jié)果顯示，IAR患者分別處于間歇期、發(fā)作期前及發(fā)作期時，IL-17表達(dá)呈逐漸增高的趨勢?？赡芴貞?yīng)性個體在與外界變應(yīng)原接觸后體內(nèi)IL-17的釋放增加，IL-17作為前炎癥因子，與受體結(jié)合后促進(jìn)相關(guān)炎癥因子釋放，對AR的發(fā)病起了促進(jìn)作用，而在間歇期，缺少變應(yīng)原刺激，Th17分化減弱，IL-17表達(dá)亦下調(diào)，患者的過敏癥狀則明顯緩解。

在對Treg／Th17的研究中，張成等［18］發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比較，中重度持續(xù)性AR患者，F(xiàn)oxp3mRNA以及血漿TGF-beta水平顯著降低，維甲酸相關(guān)孤兒受體γt及血漿IL-17水平顯著升高，這反映了AR患者體內(nèi)Treg／Th17失衡的存在［19］。本研究結(jié)果顯示，在IAR患者外周血中，Treg／Th17在間歇期、發(fā)作期前、發(fā)作期呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，這也同樣反映出Treg／Th17的不平衡。但考慮到本研究樣本例數(shù)不多，IAR患者不同階段外周血中Treg／Th17是否失衡，尚待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

［1］ Beissert S，Schwarz A，Schwarz T.Regulatory T cells［J］.J Invest Dermatol，2006，126（1）：15-24.

［2］ Carson WF 4th，Guernsey LA，Singh A，et al.Accumulation of regulatory T cells in local draining lymph nodes of the lung correlates with spontaneous resolution of chronic asthma in a murine model［J］.Int Arch Allergy Immunol，2008，145（3）：231-243.

［3］ Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3［J］.Science，2003，299（5609）：1057-1061.

［4］ Harrington LE，Hatton RD，Mangan PR，et al.Interleukin 17-roducing CD4＋effector T cells develop via lineage distinct from the T helper type 1and 2lineages［J］.Nat Immunol，2005，6（11）：1123-1132.

［5］ Mangan PR，Harrington LE，O＇Quinn DB，et a1.Transforming growth factor-beta induces development of the Th17lineage［J］.Nature，2006，441（7090）：231-234.

［6］ 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編委會鼻科組，中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會鼻科學(xué)組.變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南（2009年，武夷山）［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2009，44（12）：977-978.

［7］ Sogut A，Yilmaz O，Kirmaz C，et al.Regulatory-T，T-helper 1，and T-helper 2cell differentiation in nasal mucosa of allergic rhinitis with olive poiien sensitivity［J］.Int Arch Allergy Immunol，2012，157（4）：349-353.

［8］ Ciprandi G，de Amic M，Murdaca G，et al.Serum interleukin-17levels are related to clinical severity in allergic rhinitis［J］.Allergy，2009，64（9）：1375-1378.

［9］ Ciprandi G，F(xiàn)ilaci G，Battaglia F，et al.Peripheral Th-17cells in allergic rhinitis：new evidence［J］.Int Immunopharmacol，2010，10（2）：226-229.

［10］ Sergejeva S，Ivanov S，L?tvall J，et al.Interleukin-17as a recruitment and survival factor for airway macrophages in allergic airway inflammation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2005，33（3）：248-253.

［11］ Lee SM，Gao B，Dahl M，et al.Decreased FoxP3gene expression in the nasal secretions from patients with allergic rhinitis［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2009，140（2）：197-201.

［12］ Han D，Wang C，Lou W，et al.Allergen-specific IL-10-secreting type I T regulatory cells，but not CD4（＋）CD25（＋）Foxp3（＋）T cells，are decreased in peripheral blood of patients with persistent allergic rhinitis［J］.Clin Immunol，2010，136（2）：292-301.

［13］ Pereira-Santos MC，Baptista AP，Melo A，et al.Expansion of circulating Foxp3＋CD25bright CD4＋T cells during specific venom immunotherapy［J］.Clin Exp Allergy，2008，38（2）：291-297.

［14］ Ciprandi G，de Amici M，Negrini S，et al.TGF-beta and IL-17 serum levels and specific immunotherapy ［J］.Int Immunopharmacol，2009，9（10）：1247-1249.

［15］ Lu HG，Peng H，Chen DH，et al.Relationship between allergic symptoms and RORC2and IL-17in patients with allergic rhinitis［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2011，46（2）：144-148.

［16］ Qu SH，Li M，Huang YJ，et al.Effects of allergen and intranasal glucocorticoid on Th17and RORgamma t in peripheral blood in patients with allergic rhinitis［J］.Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi，2009，44（12）：996-1000.

［17］ Klemens C，Rasp G，Jund F，et al.Mediators and cytokines in allergic and viral-triggered rhinitis［J］.Allergy Asthma Proc，2007，28（4）：434-441.

［18］ 張成，洪蘇玲，胡國華.變應(yīng)性鼻炎患者Treg／Th17細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子的失衡表達(dá)［J］.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2012，26（5）：209-211.

［19］ Huang X，Chen Y，Zhang F，et al.Peripheral Th17／Treg cellmediated immunity imbalance in allergic rhinitis patients［J］.Braz J Otorhinolaryngol，2014，80（2）：152-155.