亞硝酸鹽對(duì)大鼠擠壓綜合征模型缺血／再灌注引起的肌肉損傷的影響

邢兆國(guó)，常軍英，賈東昭，王彥志，穆衛(wèi)廬，李琦軍

（河北省石家莊市第三醫(yī)院創(chuàng)傷一科，河北 石家莊050011）

擠壓綜合征（crush syndrome，CS）是一種嚴(yán)重的疾病，特點(diǎn)是循環(huán)性休克和腎衰竭，常發(fā)生在地震、山體滑坡和車(chē)輛事故等災(zāi)難性事件中［1］。四肢肌肉在長(zhǎng)時(shí)間擠壓（缺血）再解除擠壓（再灌注）后即可發(fā)生CS，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞破裂，即橫紋肌溶解［2］。目前，CS的推薦治療方案是生理鹽水及時(shí)補(bǔ)液，碳酸氫鹽和甘露醇糾正高鉀血癥，嚴(yán)重急性腎損傷時(shí)進(jìn)行血液透析，否則病死率升高。Nicholson等［3］報(bào)道，在缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）大鼠的心臟和肝臟細(xì)胞中，亞硝酸鹽通過(guò)缺氧依賴(lài)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用。在組織缺血的動(dòng)物模型，亞硝酸鹽給藥前或在再灌注期間，可以防止I／R損傷導(dǎo)致的心肌梗死、腦卒中和腎損傷［4］。然而，到目前為止，一直沒(méi)有實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示亞硝酸鹽對(duì)于CS的治療效果。因此，本研究制備大鼠CS模型，觀(guān)察亞硝酸鹽治療對(duì)肌肉細(xì)胞的損傷、血流動(dòng)力學(xué)和炎癥過(guò)程以及存活率的影響，旨在為臨床治療提供證據(jù)。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立與分組 雄性SD大鼠140只，均購(gòu)于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量250～300 g，其中40只隨機(jī)分為對(duì)照組、CS組、CS＋亞硝酸鈉 （NaNO2）-100 組、CS＋NaNO2-200 組、CS＋NaNO2-400組各8只。對(duì)照組不擠壓；CS組、CS＋NaNO2-100組、CS＋NaNO2-200組、CS＋NaNO2-400組均采用自制擠壓器械，壓力為3kg，連續(xù)擠壓大鼠雙下肢6h造成肢體擠壓傷后，再分別灌注生理鹽水以及不同劑量 NaNO2（100、200和400 μmol／kg）6h。另外100只用作計(jì)算生存率。

1.2 血液和組織取樣 再灌注6h后，各組大鼠取股動(dòng)脈血，應(yīng)用血液氣體分析儀檢測(cè)pH、HCO3-和堿剩余值。取下腔靜脈血，4℃，5 000r／min，離心10min，利用SRL測(cè)量血漿鉀、肌酸激酶（creatinekinase，CK）和 乳 酸 脫 氫 酶 （lactate dehydrogenase，LDH）水平。取腓腸肌和肺組織標(biāo)本進(jìn)行髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性的測(cè)量。

1.3 肌肉和血漿中的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量測(cè)定采用專(zhuān)用的高性能液相色譜系統(tǒng)檢測(cè)肌肉和血漿中的亞硝酸鹽濃度。此方法是基于用離子色譜法分離的亞硝酸鹽和硝酸鹽，然后由硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，在540nm處檢測(cè)。利用甲醇沉淀去除每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)（肌肉：甲醇=1∶2質(zhì)量／體積；血漿：甲醇=1∶1體積／體積，4℃）。

1.4 平均動(dòng)脈壓（mean arterial blood pressure，MAP）的記錄和分析 再灌注后，各組腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉（50mg／kg）進(jìn)行麻醉，記錄 MAP。股動(dòng)脈插管與壓力換能器連接到聚乙烯導(dǎo)管，通過(guò)PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，記錄血壓。

1.5 MPO活性測(cè)定 將組織樣品置于含有0.5%十六烷基三甲基溴化銨的50mmol／L磷酸鉀緩沖液（pH 6.0）中進(jìn)行勻漿，然后在冰浴中超聲處理10s，反復(fù)凍融3次后再進(jìn)行超聲處理后，4℃，12 000r／min，離心10min，分光光度法測(cè)定 MPO活性［5］。取0.1mL上清液，與2.9mL的50mmol／L磷酸鹽緩沖溶液（含有20mmol／L的過(guò)氧化氫和20 g／L的鹽酸鹽）混合，用分光光度計(jì)測(cè)定在460nm處的吸光度值。1單位表示在25℃每分鐘可降解1μmol過(guò)氧化物。

1.6 血漿白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）水平檢測(cè) 應(yīng)用大鼠IL-6的內(nèi)源性ELISA試劑盒（Endogen），根據(jù)說(shuō)明書(shū)測(cè)定血漿中IL-6的水平［6］。

1.7 生存率分析 CS組、CS＋NaNO2-100組、CS＋NaNO2-200組、CS＋NaNO2-400組大鼠各25只，分別擠壓6h后，觀(guān)察其48h的生存率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肌肉亞硝酸鹽和橫紋肌溶解標(biāo)志物的含量變化 與對(duì)照組相比，CS組損傷肌肉中亞硝酸鹽含量顯著下降，鉀、CK和LDH含量顯著增加（P＜0.05）。與CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組亞硝酸鹽的含量顯著升高（P＜0.05），其中CS＋NaNO2-400組升高最明顯（P＜0.05）；CS＋NaNO2-100、-200、-400組血漿中鉀、CK和LDH含量顯著降低（P＜0.05），其中LDH含量隨NaNO2濃度增加作用明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肌肉亞硝酸鹽和血清橫紋肌溶解標(biāo)志物含量比較Table 1 Muscle nitrite levels and plasma rhabdomyolysis markers levels in I／R-injured CS rats（n=8,±s）

表1 各組大鼠肌肉亞硝酸鹽和血清橫紋肌溶解標(biāo)志物含量比較Table 1 Muscle nitrite levels and plasma rhabdomyolysis markers levels in I／R-injured CS rats（n=8,±s）

＊P＜0.05與對(duì)照組比較 ＃P＜0.05與CS組比較 △P＜0.05與CS＋NaNO2-100組比較 ☆P＜0.05與CS＋NaNO2-200組比較（q檢驗(yàn)）

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2.2 各組大鼠血壓、pH值、HCO3-和堿剩余含量變化 與對(duì)照組相比，CS組中MAP顯著下降，血液中pH 值、HCO3-和堿剩余也顯著減少（P＜0.05）；與 CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組MAP顯著升高，血液中pH值、HCO3-和堿剩余顯著增多（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠MAP、pH、HCO3-和堿剩余比較Table 2 MAP，pH，HCO3-and BE in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

表2 各組大鼠MAP、pH、HCO3-和堿剩余比較Table 2 MAP，pH，HCO3-and BE in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

＊P＜0.05與對(duì)照組比較 ＃P＜0.05與CS組比較 △P＜0.05與CS＋NaNO2-100組比較 ☆P＜0.05與CS＋NaNO2-200組比較（q檢驗(yàn)）

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2.3 各組大鼠炎癥相關(guān)因子的變化 與對(duì)照組相比，CS組中血漿IL-6含量顯著升高（P＜0.05）；與CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組血漿IL-6含量顯著降低，但CS＋NaNO2-100、-200、-400組之間無(wú)明顯變化（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，CS組肌肉和肺中MPO的活性顯著升高（P＜0.05）；與CS組相比，CS＋NaNO2-100、-200、-400組肌肉和肺中MPO的活性顯著降低，且CS＋NaNO2-400組作用明顯（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血漿IL-6含量、肌肉和肺中MPO活性比較Table 3 IL-6level and MPO activity in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

表3 各組大鼠血漿IL-6含量、肌肉和肺中MPO活性比較Table 3 IL-6level and MPO activity in I／R-injured CS rats（n=8，±s）

＊P＜0.05與對(duì)照組比較 ＃P＜0.05與CS組比較 △P＜0.05與CS＋NaNO2-100組比較 ☆P＜0.05與CS＋NaNO2-200組比較（q檢驗(yàn)）

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2.4 各組大鼠生存率比較 CS＋NaNO2-200組和CS＋NaNO2-400組的生存率高于CS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠生存率比較Table 4 The survival rate of four groups（只數(shù)，%）

3 討 論

亞硝酸根是一氧化氮（nitric oxide，NO）氧化過(guò)程中的生理終產(chǎn)物。有研究表明，心肌中脫氧肌紅蛋白主要在線(xiàn)粒體附近釋放，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）導(dǎo)致I／R損傷［7-8］。Hendgen-Cotta等［9］報(bào)道，亞硝酸鹽可以保護(hù)小鼠心臟發(fā)生心肌梗死，在肌紅蛋白基因敲除小鼠中這種保護(hù)作用消失。因此，脫氧-肌紅蛋白可能是I／R損傷肌肉細(xì)胞中亞硝酸鹽生成NO的主要貢獻(xiàn)者［10］。在缺血期間，因?yàn)榧∪庵械膩喯跛猁}含量降低，NO氧化酶（NO synthase，NOS）活性和亞硝酸鹽消耗增加，肌肉中的基礎(chǔ)亞硝酸鹽基本用完，造成NO生物活性損失、再灌注血管內(nèi)皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的完整性損失。研究表明，亞硝酸鹽的補(bǔ)充增加了心肌組織中NO的儲(chǔ)備和生物利用度，防止I／R小鼠心臟損傷［4］。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CS組中亞硝酸鹽的含量顯著降低，而亞硝酸鹽處理后肌肉中亞硝酸鹽的含量顯著提高，最終降低橫紋肌溶解癥，并且提高生存率。

再灌注后ROS誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基是I／R損傷的可能機(jī)制之一。在I／R損傷ROS產(chǎn)生的來(lái)源包括還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷氧化酶、黃嘌呤氧化還原酶、內(nèi)皮型NOS和MPO［11］，而ROS主要來(lái)源于線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體電子傳遞鏈復(fù)合物的氧化還原狀態(tài)快速變化，ROS形成大大提高，造成再灌注時(shí)大量的電子傳遞給氧。ROS誘導(dǎo)胞漿中酶發(fā)生變性，并且破壞細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程。ROS介導(dǎo)的肌漿網(wǎng)功能障礙也導(dǎo)致大量細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死。亞硝酸鹽對(duì)I／R損傷的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制是由粒線(xiàn)體電子傳遞鏈復(fù)合物IS-亞硝基化介導(dǎo)的。S-亞硝基化的復(fù)合物I降低了線(xiàn)粒體ROS的形成，并且亞硝酸鹽減少細(xì)胞色素C釋放，抑制細(xì)胞凋亡［3］。本研究結(jié)果顯示，亞硝酸鹽治療減少了血漿中橫紋肌溶解標(biāo)志物——鉀、LDH和CK的釋放。表明亞硝酸鹽對(duì)CS受傷的肌肉細(xì)胞具有保護(hù)作用，具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

本研究為了觀(guān)察亞硝酸鹽的抗炎作用，檢測(cè)了受傷及周?chē)M織中炎癥因子IL-6的水平。IL-6升高的幅度與組織損傷嚴(yán)重程度和不良預(yù)后相關(guān)，因此，IL-6水平可用于評(píng)定患者的治療效果［12］。IL-6水平增強(qiáng)反映了血管內(nèi)皮細(xì)胞和循環(huán)中白細(xì)胞之間的異常相互作用，提示全身炎癥反應(yīng)，如多器官功能衰竭。本研究結(jié)果表明，亞硝酸鹽處理后顯著降低了血漿中IL-6水平和肌肉、肺中MPO的活性，從而減少了遠(yuǎn)程器官功能衰竭，并且提高了CS大鼠的生存率。

另外，要考慮的一個(gè)重要問(wèn)題是亞硝酸鹽治療CS是否適用于臨床上，取決于劑量、給藥途徑以及亞硝酸鹽的不良反應(yīng)——低血壓。本研究結(jié)果表明，靜脈注射200μmol／kg NaNO2后使 MAP增加，400μmol／kg NaNO2再灌注后6hMAP也維持在較高的水平，且400μmol／kg NaNO2與200 μmol／kg NaNO2處理的大鼠相比，生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。亞硝酸鹽的給藥劑量和途徑尚需進(jìn)一步研究，亞硝酸鹽治療大鼠CS模型對(duì)生存率的有利影響，可能是通過(guò)恢復(fù)和改善周邊微血管灌注和線(xiàn)粒體呼吸引起的。

綜上所述，在CS大鼠模型中靜脈給予亞硝酸鹽可以明顯降低I／R誘發(fā)肌肉損傷，并且可以提高生存率。

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