不同劑量的1，25（OH）2D3對大鼠Thy1腎炎系膜細(xì)胞凋亡的影響＊

索 潔，李建峰，趙 瑾，陶 林，楊曉萍△

（新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1．第一附屬醫(yī)院腎病科；2．病理科，新疆石河子832000）

系膜增生性腎小球腎炎（mesangial proliferative glomerulo nephritis，MsPGN）是中國原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型［1－2］，各種損傷因子引起的系膜細(xì)胞（mesangial cell，MC）增生是多種類型腎小球腎炎的共同病理表現(xiàn)，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix，ECM）的集聚是導(dǎo)致腎小球硬化和促使各種腎小球腎炎向終末期腎?。‥SRD）轉(zhuǎn)化的中心環(huán)節(jié)。有研究表明，1，25（OH）2D3可顯著抑制體外培養(yǎng)的 MC增殖、誘導(dǎo)其分化、促進(jìn)其凋亡［3］，其作用機(jī)制和原理目前尚無定論。本實(shí)通過建立大鼠抗胸腺細(xì)胞抗體（anti－Thymocyte cell－1，Thy1）腎炎［3］，給予不同劑量1，25（OH）2D3干預(yù)，用免疫組化法檢測腎小球內(nèi)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase－3）的表達(dá)，TUNEL法檢測腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡，以探討1，25（OH）2D3對MsPGN MC凋亡的影響及其可能機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 材料 選擇清潔級SD大鼠120只，體質(zhì)量（185．4±12．7）g，購自新疆地方流行性疾病控制中心。

1．2 方法

1．2．1 建立腎炎模型 將120只大鼠分為空白對照組（A組，n＝30）和實(shí)驗(yàn)組（n＝90）。A組：每只大鼠尾靜脈一次性注射生理鹽水25μL／100g；實(shí)驗(yàn)組每只大鼠尾靜脈一次性注射單克隆抗Thy1 25μL／100g后，隨機(jī)分為腎炎模型組（B組）、低劑量1，25（OH）2D3組（C組）和高劑量1，25（OH）2D3組（D組），每組30只。

1．2．2 1，25（OH）2D3干預(yù) C、D組從注射Thy1后第1天開始分別給予1，25（OH）2D3（羅鈣全）0．25、0．50μg／d，溶于1 mL花生油中灌胃，共21d。A、B組大鼠同時(shí)給予1mL花生油灌胃，各組大鼠分別于注射后第1、3、7、14、21d各處死6只大鼠，留取腎臟標(biāo)本待測。

1．2．3 檢測1，25（OH）2D3對 MsPGN組織損害的影響 腎組織經(jīng)HE和PAS染色后在光鏡下觀察MC和ECM增生情況，并根據(jù)病理損害程度進(jìn)行分級。參照人MsPGN分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。

1．2．4 免疫組化技術(shù)檢測腎小球中Caspase－3的表達(dá)Caspase－3陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出血棕黃色顆粒。高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取選5個(gè)腎小球，觀察染色細(xì)胞的面積和強(qiáng)度，計(jì)算其平均值。

1．2．5 TUNEL法測腎組織細(xì)胞凋亡 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色。高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取10個(gè)腎小球計(jì)數(shù)，凋亡細(xì)胞占腎小球內(nèi)有核細(xì)胞的比例為陽性率，分別計(jì)數(shù)各組腎小球內(nèi)的陽性細(xì)胞。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所以數(shù)據(jù)采用SPSS19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用x±s表示，組間和組內(nèi)比較采用方差分析，其中兩兩比較用SNK－q檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 1，25（OH）2D3對Thy1腎炎腎小球損害程度及病理損害的影響 A組大鼠腎組織均為正常腎組織，光鏡下未見MC和ECM增生；B組在各時(shí)間點(diǎn)均可見MC增生，其增生程度隨著時(shí)間的延續(xù)呈加重趨勢，并可見毛細(xì)血管袢受壓嚴(yán)重，出現(xiàn)結(jié)節(jié)和團(tuán)塊狀實(shí)性區(qū)，部分腎小球出現(xiàn)分葉、硬化和纖維化，至14d時(shí)MC增生減輕；與B組比較，C、D組大鼠腎組織在各時(shí)間點(diǎn)MC增生程度均顯著減輕（P＜0．05），鏡下可見毛細(xì)血管袢輕度受壓，系膜寬度未超過毛細(xì)血管直徑，呈節(jié)段性分布；C、D組大鼠腎組織在各時(shí)間點(diǎn) MC增生程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1、圖1（只比較 A、B、D組病理PAS染色結(jié)果，圖2、3相同）。

表1 各組不同時(shí)間腎組織病變程度積分值比較（x±s，n＝6）

圖1 不同時(shí)間段、不同組間PAS染色結(jié)果（×400）

表2 不同時(shí)段各組間腎小球內(nèi)Caspase－3的表達(dá)量（x±s，n＝6）

圖2 不同時(shí)段、不同組間Caspase－3的表達(dá)結(jié)果

圖3 不同組間、不同時(shí)段腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞結(jié)果

表3 TUNEL測定不同時(shí)間段各組間腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（x±s，n＝6）

2．2 Caspase－3在各組腎小球中的表達(dá)量比較 Caspase－3為細(xì)胞質(zhì)著色，呈淡黃色或黃色。A組腎小球中無Caspase－3的表達(dá)；B組第1天腎小球細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見Caspase－3的表達(dá)，第3天有所下降，在第7天時(shí)明顯增多，第14天表達(dá)再度減少，第21天持續(xù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與B組比較，C、D組在各時(shí)段均有Caspase－3的表達(dá)，趨勢與B組相同，且表達(dá)量高于B組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；D組表達(dá)較C組更強(qiáng)，C、D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。各組腎小球內(nèi)Caspase－3的表達(dá)量，見表2、圖2。

2．3 1，25（OH）2D3對腎組織細(xì)胞凋亡的影響 A組腎小球內(nèi)有少量凋亡細(xì)胞；B組在不同時(shí)間段內(nèi)均可見陽性凋亡細(xì)胞，隨著時(shí)間延長逐漸增多；與B比較，C、D組在第1天即可見較多的凋亡細(xì)胞，3d達(dá)高峰，7、14d開始下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；C組細(xì)胞凋亡數(shù)量3d時(shí)較D組高，余各時(shí)段均較D組低，但C、D組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表3、圖3。

3 討 論

作為腎小球內(nèi)的固有細(xì)胞之一，MC異常增殖及其繼發(fā)的炎癥介質(zhì)釋放、ECM的病理性聚集，是導(dǎo)致腎小球硬化，使各種腎小球腎炎向ESRD發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。因此，采用各種干預(yù)措施維持MC增生、肥大與凋亡之間的平衡及改善系膜基質(zhì)代謝是延緩或逆轉(zhuǎn)腎小球硬化的關(guān)鍵。所以，尋找抑制MC增生、誘導(dǎo)MC凋亡的藥物對于臨床上治療各種腎小球腎炎具有重要意義。國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)1，25（OH）2D3除了經(jīng)典的鈣磷代謝調(diào)節(jié)功能外，還具有多種生物功能，如抑制多種腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞的增殖等［4－8］，1，25（OH）2D3對 MC有無作用及是何種作用，本課題組前期的研究已經(jīng)證實(shí)，1，25（OH）2D3能夠有效抑制體外培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞增殖［9］。

在本實(shí)驗(yàn)中，使用TUNEL法測定腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞凋亡后發(fā)現(xiàn)，腎炎組腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡隨時(shí)間推移逐漸增多，而使用1，25（OH）2D3干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組在藥物干預(yù)后第1天開始凋亡細(xì)胞就明顯增多，并在第3天到達(dá)高峰，此后逐漸降低，提示1，25（OH）2D3可早期誘導(dǎo)GCM凋亡，對腎臟具有保護(hù)作用。此外，研究結(jié)果還提示，1，25（OH）2D3的作用強(qiáng)度與劑量相關(guān)，高劑量較低劑量作用更為明顯。另外，與B組相比，C、D組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的組織形態(tài)學(xué)改變也明顯減輕；第7天腎臟病理顯示MC以及ECM明顯減少，炎癥因子積聚減輕，球囊粘連偶爾可見等，說明1，25（OH）2D3對于Thy1腎炎的調(diào)控不僅是在抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，而且也體現(xiàn)在組織形態(tài)學(xué)改變方面。

在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)、發(fā)展過程中，有許多基因及其產(chǎn)物的參與，其調(diào)控過程十分復(fù)雜，目前已知的凋亡信號傳導(dǎo)通路有死亡受體途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，均能激活Caspase－3［10－15］，并可通過水解各種細(xì)胞成分而使細(xì)胞凋亡。在本研究中，對照組中腎小球中無Caspase－3的表達(dá)，B組在Thy1抗體注射后1d即出現(xiàn)Caspase－3的表達(dá)，出現(xiàn)第1個(gè)表達(dá)高峰，這與注射Thy1抗體后1d內(nèi)出現(xiàn)系膜細(xì)胞核固縮、細(xì)胞溶解有關(guān)；第3天時(shí)有所下降；隨著腎炎病程的發(fā)展，增生的系膜細(xì)胞及浸潤的炎細(xì)胞通過細(xì)胞凋亡途徑而清除，Caspase－3在第7天時(shí)再次升高，出現(xiàn)第2個(gè)表達(dá)高峰；在第14天和第21天的檢測中持續(xù)下降。C、D組總體趨勢與B組相同，但表達(dá)量更高，其中以D組的表達(dá)最強(qiáng)，C組次之，但各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。本實(shí)驗(yàn)通過使用不同劑量1，25（OH）2D3干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，Caspase－3的表達(dá)與藥物劑量呈正相關(guān)，提示在本實(shí)驗(yàn)中1，25（OH）2D3參與了對Caspase－3的調(diào)節(jié)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，促進(jìn)Thy1腎炎的轉(zhuǎn)歸。

綜上所述，本研究證實(shí)了1，25（OH）2D3具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，且受藥物劑量影響，高劑量的1，25（OH）2D3在誘導(dǎo)系膜細(xì)胞凋亡中的作用最強(qiáng)。1，25（OH）2D3參與了腎小球中Caspase－3的調(diào)控，并在Thy1腎炎早期誘導(dǎo)腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了炎癥的修復(fù)，從而早期延緩腎小球疾病的進(jìn)展，保護(hù)腎臟。

［1］ 張路霞，王梅，王海燕，等．CKD的流行病學(xué)研究［J］．中華腎臟病雜志，2005，21（7）：425－427．

［2］ Abdelsamie SA，Li Y，Huang Y，et al．Oxidized LDL immune complexes stimulate collagenⅣproduction in mesangial cell via Fc gamma receptors Ⅰ and Ⅲ ［J］．Clin Immunol，2011，139（3）：258－266

［3］ 趙丹，楊曉萍，張春江，等．1，25（OH）2D3對大鼠腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響［J］．臨床與實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（7）：486－487．

［4］ Chen D，Li Y，Dai X，et al．1，25－Dihydroxyvitamin D3activates MMP13gene expression in chondrocytes through p38MARK pathway［J］．Int J Biol Sci，2013，9（6）：649－655．

［5］ Hashimoto K，Kamijo Y，Nakajima T，et al．PPARαactivation protects against anti－Thy1nephritis by suppressing glomerular NF－κB signaling［J］．PPAR Res，2012，10（10）：1－11

［6］Ingraham BA，Bragdon B，Nohe A．Molec ular basis of the potential of vitamin D to prevent cancer［J］．Curr Med Res Opin，2008，24（1）：139－149．

［7］ Mullin GE，Dobs A．Vitamin D and its role in cancer and immune－ty：aprescription for sunlight［J］．Nutr Clin Pract，2007，22（3）：305－322．

［8］ Zhuo L，F(xiàn)u B，Bai X，et al．NAD blocks high glucose induced mesangial hypertrophy via activation of the Sirtuins－AMPK－mTOR pathway［J］．Cell Physiol Biochem，2011，27（6）：681－690．

［9］ 張春江，楊曉萍，賀德剛，等．1，25（OH）2D3對大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制探討［J］．山東醫(yī)藥，2011，51（47）：32－34．

［10］戴昕，李占全，冀林華．凋亡相關(guān)蛋白Caspase研究進(jìn)展［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2010，12（4）：130－132．

［11］Scatena R，Bottoni P，Botta G，et al．The role of mitochondria in pharmacotoxicology：a reevaluation of an old，newly emerging topic［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2007，6（293）：C12－21．

［12］Sun Y，Liu G，Song T，et al．Upregulation of GRP78and caspase－12in diastolic failing heart ［J］．Acta Biochim Pol，2008，55（3）：511－516．

［13］Martinou JC，Youle RJ．Mitochondria in apoptosis：Bcl－2 family members and mitochondrial dynamics［J］．Dev Cell，2011，21（1）：92－101．

［14］Dai Z，Gao J，Ji Z，et al．Matrine induces apoptosis in gastric carcinoma cell via alteration of Fas／FasL and activation of caspase－3［J］．J Ethnopharmacol，2009，123（1）：91－96．

［15］Kim EM，Shin EJ，Choi JH，et al．Matrix metalloproteinase－3is increased and participates in neuronal apoptotic signaling downstream of caspase－12during endoplasmic reticulum stress［J］．J Biol Chem，2010，285（22）：16444－16452．