肺癆靈合劑的制備工藝研究

張娜娜 徐文崢 朱建麗

[摘要] 目的 優(yōu)選肺癆靈合劑的制備工藝。 方法 根據(jù)處方中藥材性質(zhì)的不同，以揮發(fā)油提取量為指標(biāo)，采取水蒸氣蒸餾法提取山臘梅；以黃芪甲苷含量為檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及單因素試驗(yàn)考察，優(yōu)選其他藥材水提取工藝；然后再用乙醇沉淀法除雜，最后采用熱處理溶解、吐溫-80增溶即得。 結(jié)果 肺癆靈合劑最佳制備工藝為加入5倍處方量水，提取煎煮2次，每次2 h，乙醇醇沉體積分?jǐn)?shù)為60%，熱處理時(shí)間為20 min，采用1.5%樣品量吐溫-80進(jìn)行揮發(fā)油增溶。 結(jié)論 優(yōu)選的肺癆靈合劑制備工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，為肺癆靈合劑的開(kāi)發(fā)提供參考。

[關(guān)鍵詞] 肺癆靈合劑；黃芪甲苷；正交試驗(yàn)；澄清度

[中圖分類號(hào)] R283.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）02（c）-0078-04

肺結(jié)核，中醫(yī)稱為“肺癆”，是當(dāng)今世界傳染病中的主要?dú)⑹?，我?guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)占全球發(fā)病人數(shù)比例為14.3%，位居世界第2位[1]，近年來(lái)其發(fā)病率不

斷上升，嚴(yán)重危害到人們的身體健康，同時(shí)給公共衛(wèi)生問(wèn)題帶來(lái)新的困難和挑戰(zhàn)[2-3]。目前肺結(jié)核已成為我國(guó)重點(diǎn)控制的傳染病，多地指定了肺結(jié)核定點(diǎn)治療醫(yī)院?，F(xiàn)階段肺結(jié)核的治療主要以化學(xué)藥物為主，化學(xué)藥物可以使結(jié)核病灶纖維化和鈣化，進(jìn)而達(dá)到痊愈的效果。但該抗結(jié)核化療過(guò)程較長(zhǎng)，且需要聯(lián)合用藥，藥物蓄積較多，產(chǎn)生各種各樣毒副反應(yīng)，增加了患者的痛苦[4-6]。同時(shí)結(jié)核桿菌將機(jī)體蛋白用于自身代謝，致使機(jī)體負(fù)氮平衡，營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂，抵抗力低下。中醫(yī)藥治療肺結(jié)核注重扶助正氣，提高人體抵抗力，亦能降低化學(xué)藥物的毒副作用，提高患者依從性，使患者順利完成全程治療，因此中醫(yī)藥防治肺結(jié)核越來(lái)越受到人們的重視并得到廣泛研究。

肺癆靈合劑為浙江省麗水市中醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）自主研發(fā)口服中藥制劑，該方主要由黃芪、黃精、百部、白及、山臘梅等多味中草藥組成，具有滋陰潤(rùn)肺、健脾補(bǔ)腎、扶正固本之功效。前期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：該合劑聯(lián)合常規(guī)西藥輔助治療初治肺結(jié)核，臨床治愈療效和顯效方面得到顯著改善；嚴(yán)重胃腸道反應(yīng)、肝功能損害及白細(xì)胞減少等副作用的發(fā)生率顯著降低，T淋巴細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平均有不同程度的上升，CD8+、白介素（IL）-1及IL-6水平均有不同程度下降，表明肺癆靈合劑能夠提高機(jī)體免疫功能。

前期臨床試驗(yàn)中，肺癆靈合劑的制備方法為加入4倍處方量的水，浸泡0.5 h，采用全自動(dòng)煎藥機(jī)煎煮1 h。為促進(jìn)該方更好、更廣泛地用于臨床，本文對(duì)其制備工藝進(jìn)行了研究。根據(jù)處方中草藥藥效成分的性質(zhì)及前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，擬訂該制劑的制備工藝路線為山臘梅采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，水提醇沉提取其他味中藥材，最后將提取物配液混合，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)選肺癆靈合劑提取工藝，為該制劑的進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1200高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）：Alltech2000 ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)奧泰科技<中國(guó)>有限公司），Sartorius BS 124S電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

1.2 試劑與試藥

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-200613）由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，黃芪、五味子、麥冬、百部等中藥飲片均購(gòu)于杭州桐君堂醫(yī)藥藥材有限公司，經(jīng)我院制劑室林娜副主任中藥師鑒定為正品，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部[7]規(guī)定。乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水（自制），其余試劑為分析純，吐溫-80為藥用規(guī)格。

2 方法與結(jié)果

根據(jù)處方中藥材的性質(zhì)，山臘梅主要含有要含有1，8-桉油素（1，8-cineole）、檜烯（sabinene）、β-蒎烯等揮發(fā)油成分[8-9]，其中桉油素含量最大，采用水蒸氣蒸餾法提取。黃芪、黃芩、百合、黃精等其他味藥材主要藥效成分為皂苷、黃酮及其苷、糖、酸、生物堿等，均易溶于水[10-23]，故采用水煎煮法提取。

2.1 山臘梅揮發(fā)油提取工藝優(yōu)選

在前期預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，取處方量的山臘梅碎葉片，加入6倍處方量的水，浸泡6 h，待藥材充分浸透后，采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，分別讀取1～7 h揮發(fā)油提取量，記錄結(jié)果分別為2.05、2.60、3.05、3.45、3.60、3.65、3.65 mL。該提取記錄結(jié)果提示：6、7 h揮發(fā)油提取量最大，但4 h后揮發(fā)油已基本提取完全，為節(jié)約時(shí)間和能源，選定揮發(fā)油提取時(shí)間為4 h。分別稱取3份同批次1個(gè)處方量的山臘梅碎葉片，按照文中確定的工藝路線提取揮發(fā)油，分別記錄揮發(fā)油提取量，結(jié)果提取量平均為3.38 mL，與優(yōu)選的工藝提取結(jié)果接近，表明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

2.2 水提取工藝優(yōu)選

2.2.1 水提取工藝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黃芪甲苷含量為檢測(cè)指標(biāo)，選擇L9（34）正交試驗(yàn)表，對(duì)煎煮時(shí)間、提取次數(shù)、加水量進(jìn)行考察，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 水提取工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.2.2 黃芪甲苷的含量測(cè)定

2.2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；乙腈-水（33∶67）為流動(dòng)相；柱溫30℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；ELSD參數(shù)：漂移管溫度101℃，氣體流速2.7 L/min，氮?dú)猓兌?9.9%）壓力25 Pa；按照檢測(cè)指標(biāo)黃芪甲苷計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于4000。

2.2.2.2 黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備 稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量，用微量分析天平精密稱定，置于容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制備成每1毫升含1 mg黃芪甲苷的溶液，即得，作為對(duì)照品溶液[7]。

2.2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取肺癆靈合劑樣品30 mL，置于250 mL分液漏斗中，分別加入60、40、40、40 mL水飽和正丁醇溶液振搖提取，合并下層正丁醇溶液，然后用40 mL氨試液洗滌2次，丟棄氨試液層，減壓回收正丁醇溶液，得暗黃色殘?jiān)?，加?0 mL蒸餾水使殘?jiān)芙?，放冷，將樣品溶液過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），先用重蒸水50 mL洗脫，水層棄去；繼用 40%乙醇溶液50 mL洗脫，棄去40%乙醇洗脫液，最后用70%乙醇溶液100 mL洗脫，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮至干，殘?jiān)蒙倭考状既芙獠⒁浦? mL的容量瓶中，然后加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液[7]。

2.2.3 水提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按“2.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2水提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果可以看出，影響黃芪甲苷提取率的各因素主次為A（煎煮時(shí)間）>C（加水量）>B提取次數(shù)，其中煎煮時(shí)間的影響最為顯著，其次是加水量，提取次數(shù)的影響最小，水提取最佳工藝為A3B2C3，即加入6倍處方量的水，煎煮提取2次，每次2 h。表3正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析中數(shù)據(jù)顯示煎煮時(shí)間影響顯著，而加水量及提取次數(shù)的影響無(wú)顯著性差異，綜合考慮耗時(shí)耗能，故確定最佳水提工藝為A3B2C2，即加入5倍處方量水，煎煮提取2次，每次2 h。

2.2.4 水提取工藝試驗(yàn)驗(yàn)證

分別稱取3份同批次1個(gè)處方量藥材（共940 g），按照上述選擇的優(yōu)選工藝（加入5倍處方量水，煎煮提取2次，每次2 h）煎煮中藥材，測(cè)定樣品黃芪甲苷含量，黃芪甲苷提取率分別為53.43%、54.04%、53.78%，3次黃芪甲苷提取率平均值為53.75%，表明優(yōu)選的水提取工藝穩(wěn)定可重復(fù)。

2.3 醇沉工藝優(yōu)選

中藥材制備提取過(guò)程中常常利用醇沉的方法來(lái)去除雜質(zhì)。一般情況下醇沉濃度越高，越有利于去除雜質(zhì)，但雜質(zhì)去除的同時(shí)也會(huì)帶走部分有效成分，導(dǎo)致有效成分含量下降。為了既保證最大限度除去雜質(zhì)，同時(shí)又盡量減少有效活性成分的損失，對(duì)不同濃度乙醇的醇沉效果進(jìn)行了比較研究，分別選擇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%的乙醇進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定醇沉后黃芪甲苷的含量[20-24]。

分別稱取同批次處方量藥材3份，加入5倍處方量的水，煎煮提取2次，每次2 h，煎煮完成后合并水煎煮液，然后將水提取液減壓濃縮至適量，放冷至室溫后，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%、70%、80%、90%的乙醇進(jìn)行醇沉，測(cè)定醇沉液中黃芪甲苷質(zhì)量濃度，計(jì)算醇沉后黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率。記錄結(jié)果顯示，用體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%、90%乙醇沉淀黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率分別為52.10%、50.63%、43.24%、37.85%，數(shù)據(jù)表明80%以上濃度醇沉黃芪甲苷有損失，60%和70%醇沉差異無(wú)顯著性，因此采用60%醇沉工藝。對(duì)3份同批次1個(gè)處方量的藥材進(jìn)行醇沉工藝試驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果顯示黃芪甲苷平均轉(zhuǎn)移率為52.23%，與選取結(jié)果較近，表明醇沉工藝穩(wěn)定可行。

2.4成型工藝

2.4.1 配液工藝優(yōu)選

分別稱取同批次4 個(gè)處方量的藥材，加入5倍量水，煎煮提取2次，每次2 h，然后水煎煮液合并減壓濃縮至適量，放冷，加入體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇醇沉，制得樣品浸膏，然后將樣品平均分成4份，分別加水至1 L，混勻，加入等量活性炭，煮沸熱處理時(shí)間分別為0、10、20、30 min，趁熱濾過(guò)，濾液放冷后置冰柜中冷藏3 d，自然沉降，離心分離，灌封，滅菌，得樣品。靜置觀察性狀，結(jié)果顯示只有熱處理時(shí)間為20、30 min的樣品保持澄清。測(cè)定所得樣品中黃芪甲苷質(zhì)量濃度，記錄結(jié)果分別為87.48、87.22、87.00、87.03 μg/mL。該結(jié)果表明采用先加熱處理再冷藏的方式可以提高肺癆靈合劑的澄清度，熱處理20 min即可使肺癆靈合劑達(dá)到澄清狀態(tài)，為節(jié)時(shí)節(jié)能，故選擇熱處理時(shí)間為20 min。

2.4.2 揮發(fā)油增溶工藝考察

分別量取5份制備好的樣品溶液500 mL，置于1 L燒杯中，各取出樣品溶液100 mL，然后分別加入2.5、5.0、7.5、10、12.5 mL吐溫-80和3.4 mL揮發(fā)油攪拌制成乳劑后，加入到剩余400 mL樣品溶液中，置冰柜中冷藏2 d，離心、抽濾、灌封、高壓滅菌，得肺癆靈合劑，觀察其澄清度變化[25-26]。結(jié)果顯示，吐溫-80的用量為樣品量的1.5%～2%時(shí)溶液澄清度較好，因此為減少增溶劑吐溫-80的用量，節(jié)約成本，選擇吐溫-80用量為1.5%。分別稱取3批按照優(yōu)選揮發(fā)油提取工藝、水提醇沉工藝、配液工藝制得樣品溶液，分別加入1.5%樣品量的吐溫-80進(jìn)行揮發(fā)油增溶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癆靈合劑澄清度良好，表明該增溶工藝穩(wěn)定、可行。

2.5 肺癆靈合劑制備工藝驗(yàn)證

分別稱取15份同批次處方量的藥材，均按照上文中確定的最佳制備工藝制備肺癆靈合劑樣品，分別讀取揮發(fā)油提取量、計(jì)算黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率、觀察樣品溶液的澄清度，數(shù)據(jù)顯示揮發(fā)油平均提取量為3.35 mL，黃芪甲苷質(zhì)量濃度平均為87.01 μg/mL，合劑澄清，均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求且工藝基本穩(wěn)定。

3 討論

肺癆靈合劑為我院自主研發(fā)免疫類中藥協(xié)定處方，臨床用于輔助治療肺結(jié)核，能明顯提高機(jī)體免疫力，減輕常規(guī)化學(xué)藥物的不良反應(yīng)，提高患者依從性。但該復(fù)方藥材種類繁多，成分復(fù)雜，制備方法科學(xué)與否直接影響其臨床療效，探索研究該湯劑的制備工藝，是保證肺癆靈合劑質(zhì)量的重要方法。本文根據(jù)處方中藥材性質(zhì)的不同，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討了先利用水蒸氣蒸餾法提取山臘梅揮發(fā)油，然后用水煎煮法提取其他藥味水溶性成分，最后再將揮發(fā)油與水提液浸膏樣品混合的制備方法。最終得到的肺癆靈合劑最佳制備工藝方案是：山臘梅碎葉片中揮發(fā)油提取方法為水蒸氣蒸餾法，提取時(shí)間為4 h；其他味藥材藥材加入5倍處方量水，提取2次，每次煎煮2 h；用體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇醇沉；加入1.5%樣品量吐溫-80促進(jìn)揮發(fā)油增溶。經(jīng)工藝驗(yàn)證，該制備工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，能有效控制肺癆靈合劑的質(zhì)量。

研究肺癆靈合劑制備工藝過(guò)程中還考察了黃芪甲苷供試品溶液的制備方法中過(guò)柱、水飽和正丁醇溶液的萃取體積、萃取次數(shù)及氨試液洗滌次數(shù)對(duì)黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果表明：不過(guò)柱時(shí)黃芪甲苷與相鄰峰分離度達(dá)不到要求；水飽和正丁醇溶液提取4次，每次分別為60、40、40、40 mL時(shí)，提取效果最好；氨試液洗滌2次和3次，黃芪甲苷提取率無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)曾參考有關(guān)文獻(xiàn)，選用乙腈-水（33∶67）為流動(dòng)相、乙腈-水-四氫呋喃（33∶67∶4）為流動(dòng)相，流速：0.8 mL/min，以Aichrom Reliasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱為分析柱，柱溫為25℃，ELSD參數(shù)：漂移管溫度70℃，氮?dú)鈮毫?5 Pa，進(jìn)行試驗(yàn)研究，結(jié)果兩者達(dá)到滿意的分離效果，黃芪甲苷峰已達(dá)基線分離，峰形對(duì)稱；缺黃芪陰性對(duì)照樣品均無(wú)干擾。本實(shí)驗(yàn)選用乙腈-水（33∶67）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫為30℃；用Alltech2000 ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)：漂移管溫度101℃，氣體流速2.7 L/min。

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（收稿日期：2014-11-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）