不同離心條件和抗凝劑對(duì)凝血功能檢測(cè)結(jié)果的影響

左 燦，王艷蘭，李海英，卿之駒△

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410011；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410007)

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·論 著·

不同離心條件和抗凝劑對(duì)凝血功能檢測(cè)結(jié)果的影響

左 燦1，王艷蘭1，李海英2，卿之駒1△

(1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410011；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長(zhǎng)沙 410007)

目的 探討不同離心條件和抗凝劑對(duì)凝血功能檢測(cè)結(jié)果的影響。方法 采用不同的離心速度和離心時(shí)間、兩種不同的抗凝劑，用STA-R型全自動(dòng)血凝儀分別測(cè)定其凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、抗凝血酶Ⅲ活性(ATⅢ)、纖維蛋白原(Fib)、D-二聚體(D-D)和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)。結(jié)果 與3 000 r/min離心10 min組測(cè)定結(jié)果比較，除3 000 r/min離心5 min組PT、TT、ATⅢ、Fib的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余各組的凝血功能檢查結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與枸櫞酸鈉抗凝血檢測(cè)結(jié)果相比，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝血使PT、APTT、TT延長(zhǎng)，ATⅢ活性增高(P<0.05)，而Fib、D-D、FDP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 3 000 r/min離心10 min為凝血功能檢測(cè)的最佳離心條件，且測(cè)定Fib、D-D、FDP時(shí)臨床可用EDTA-K2抗凝血替代，其余均必須使用枸櫞酸鈉抗凝血。

凝血功能； 離心條件； 枸櫞酸鈉； 乙二胺四乙酸二鉀

隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，凝血功能檢測(cè)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于臨床。目前，凝血功能已作為常規(guī)檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)用于患者手術(shù)前準(zhǔn)備、抗凝藥物劑量的監(jiān)測(cè)、出血性疾病或血栓性疾病的初步診斷與療效評(píng)估[1]。而伴隨著全自動(dòng)血凝儀的廣泛使用，凝血功能檢測(cè)變得更快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和可靠的同時(shí)，也使標(biāo)本前處理的重要性日益突出。其中，離心條件對(duì)凝血功能檢測(cè)質(zhì)量至關(guān)重要[2]。與此同時(shí)，由枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管所造成的標(biāo)本采集比例不符及血液凝固在臨床上尤為常見(jiàn)，而重新對(duì)患者采血不僅增加了患者的痛苦，更耽誤時(shí)間。乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝的血常規(guī)檢查在臨床上更為常見(jiàn)，同樣作為抗凝血，其是否可用于凝血功能檢測(cè)這一設(shè)想給了作者啟發(fā)。本研究旨在尋求凝血功能檢測(cè)的最佳離心條件，并以枸櫞酸鈉和EDTA-K2兩種抗凝血對(duì)60例門(mén)診隨機(jī)病例進(jìn)行凝血功能檢測(cè)對(duì)比，以探討不同抗凝劑對(duì)凝血功能的檢查結(jié)果是否具有影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2013年12月至2014年4月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院門(mén)診就診的患者60例，以109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管采集靜脈血1.8 mL、EDTA-K2抗凝管采集靜脈血2 mL，充分混勻，以3 000 r/min離心10 min分離血漿，并于室溫下2 h內(nèi)檢測(cè)。健康志愿者30例，各順利采血7.2 mL，每人份血樣分別放于4支109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝管中(每支1.8 mL)，使抗凝劑與血液的比例為1∶9。充分混勻后，分別以3 000 r/min離心5 min，1 000、2 000、3 000 r/min各離心10 min分離血漿，并于室溫下2 h內(nèi)檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 一次性使用真空采血管[109 mmol/L枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝管和EDTA-K2抗凝管]；低速離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)；STA-R Evolution全自動(dòng)血凝儀(法國(guó)Diagnostic Stago公司生產(chǎn))；凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、抗凝血酶Ⅲ活性(ATⅢ)、纖維蛋白原(Fib)、D-二聚體(D-D)的檢測(cè)均采用該公司提供的原裝配套試劑盒；纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(FDP)檢測(cè)試劑由日本積水株式會(huì)社提供。

1.3 凝血功能檢測(cè) 將所收集的血漿標(biāo)本置于STA-R型全自動(dòng)血凝儀上進(jìn)行凝血功能的檢測(cè)。其中，PT、APTT、TT、Fib的檢測(cè)采用凝固法，ATⅢ的檢測(cè)采用發(fā)色底物法，D-D和FDP的檢測(cè)則采用免疫比濁法。按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)檢測(cè)，先檢測(cè)質(zhì)控品，觀察是否在控，然后再進(jìn)行臨床標(biāo)本分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同離心條件下凝血功能檢測(cè)結(jié)果的比較 對(duì)30例健康志愿者的4管枸櫞酸鈉抗凝血以不同條件離心后，其凝血功能檢測(cè)結(jié)果分析如下：相同離心速度、不同離心時(shí)間條件下，PT、TT、ATⅢ、Fib的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，APTT、D-D和FDP則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而相同時(shí)間、不同離心速度的條件下，凝血功能各項(xiàng)檢查結(jié)果的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 兩種抗凝劑凝血功能檢測(cè)結(jié)果的比較 對(duì)60例門(mén)診隨機(jī)患者的不同抗凝血進(jìn)行凝血功能檢測(cè)，其結(jié)果分析如下：EDTA-K2抗凝血的PT、APTT、TT、ATⅢ均高于枸櫞酸鈉抗凝血(P<0.05)，而兩者Fib、D-D、FDP檢測(cè)結(jié)果的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 不同離心條件凝血功能檢測(cè)結(jié)果比較±s)

注：與3 000 r/min離心10 min測(cè)定結(jié)果比較，*P<0.05。

表2 兩種抗凝劑凝血功能檢測(cè)結(jié)果比較±s)

注：與枸櫞酸鈉抗凝血測(cè)定結(jié)果比較，*P<0.05。

3 討 論

凝血功能是指機(jī)體在血管受損時(shí)所具有的，由凝血因子按照一定順序相繼激活而生成凝血酶，最終使纖維蛋白原變成纖維蛋白，而促使血液凝固的能力。凝血功能檢查是判斷機(jī)體止血與凝血系統(tǒng)病理變化、術(shù)前篩查出凝血性疾病的重要指標(biāo)，是目前臨床用于診斷與觀察血栓形成、抗凝治療療效的常用檢測(cè)方法，多用于術(shù)前了解患者有無(wú)凝血功能的異常，有效地防止在術(shù)中及術(shù)后出現(xiàn)出血不止等意外情況，從而獲得最佳的手術(shù)效果[3-4]。

PT、APTT、TT、ATⅢ、Fib、D-D、FDP 7項(xiàng)凝血功能檢測(cè)指標(biāo)是目前臨床上判斷出血性疾病類型的主要診斷指標(biāo)。其中，PT主要反映外源性凝血系統(tǒng)的功能，可反映血漿中凝血酶原及凝血因子Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ水平的變化，是監(jiān)測(cè)口服抗凝藥物療效的首選指標(biāo)[5]。APTT是內(nèi)源性凝血因子缺乏最可靠的篩選試驗(yàn)，可反映血漿中凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ水平的變化，可以作為普通肝素治療的首選監(jiān)護(hù)指標(biāo)[6]。TT主要是對(duì)血中循環(huán)抗凝物質(zhì)的篩查，實(shí)際上反映了血漿中Fib的含量，可用于溶栓治療的監(jiān)測(cè)。ATⅢ作為絲氨酸蛋白酶抑制家族的一員，是由肝臟產(chǎn)生的凝血系統(tǒng)中最重要的抗凝因子，在體內(nèi)有著非常重要的抗凝調(diào)節(jié)作用[7]。Fib則是血漿中含量最高的一種糖蛋白，作為重要的凝血因子，是參與止血和血栓形成的主要物質(zhì)，亦可作為纖溶篩查的指標(biāo)[8]。D-D是纖溶酶作用于交聯(lián)纖維蛋白的一種特異性降解產(chǎn)物，是診斷活動(dòng)性纖溶較好的指標(biāo)，也可作為溶栓藥物的治療監(jiān)測(cè)指標(biāo)[9-10]。FDP是纖維蛋白或纖維蛋白原在纖溶酶的作用下，被分解后所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物的總稱，主要反映纖維蛋白溶解系統(tǒng)的功能狀況。

在實(shí)際進(jìn)行凝血功能檢測(cè)的操作過(guò)程中，由于急診或樣本量大等，容易造成許多不規(guī)范的操作，從而引起一些系統(tǒng)性的誤差。尤其是在某些分工合作的醫(yī)院，其檢測(cè)項(xiàng)目分工很細(xì)，通常每人只需完成某一個(gè)步驟，因此，為了保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，必須建立統(tǒng)一的操作規(guī)范，嚴(yán)格進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。從表1可知，離心條件對(duì)凝血功能的檢測(cè)具有明顯的影響，標(biāo)本離心條件不同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果會(huì)不一致，因此，合適的離心速度和離心時(shí)間是保證凝血功能檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的必要條件。而目前，國(guó)內(nèi)外基于此點(diǎn)的研究不在少數(shù)，但其結(jié)果報(bào)道不盡相同。高長(zhǎng)鳳[11]認(rèn)為APTT的最適離心速度是3 000 r/min，PT最合適的離心速度則為2 000 r/min；朱忠勇[12]則推崇PT、APTT、TT均在相對(duì)離心速度2 000～3 000 r/min離心30 min的情況下檢測(cè)。而本研究結(jié)果顯示，除PT、TT、ATⅢ、Fib檢測(cè)時(shí)3 000 r/min離心5 min和10 min的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各組的凝血功能檢查結(jié)果均具有顯著差異，與Watanabe等[13]的報(bào)道結(jié)果一致。這說(shuō)明了當(dāng)離心時(shí)間過(guò)短或離心速度不夠時(shí)，血漿便得不到徹底的分離，致使血漿中仍殘留有部分的血小板，未達(dá)到凝血功能檢測(cè)所需要的血小板血漿的水平，從而激活某些內(nèi)、外源性凝血因子，導(dǎo)致結(jié)果偏差[14]。一般說(shuō)來(lái)，APTT檢測(cè)要求貧血小板血漿，以避免血小板活化對(duì)試驗(yàn)造成干擾，PT檢測(cè)的要求則相對(duì)低一些，而TT等的檢測(cè)則并未提及具體的離心要求。綜上所述，進(jìn)行凝血功能檢測(cè)時(shí)，應(yīng)以APTT的離心條件為準(zhǔn)，即3 000 r/min離心10 min應(yīng)為凝血功能檢測(cè)的最佳離心條件。在此前提下，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程執(zhí)行，做好試驗(yàn)的質(zhì)量控制，進(jìn)而可提高檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

而目前臨床上由枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管所造成的抗凝劑與血液標(biāo)本的比例不符、血液凝固等問(wèn)題給檢驗(yàn)工作帶來(lái)了巨大困擾。其可能由臨床采血時(shí)操作不甚熟練造成，主要的原因是采血不暢，尤其見(jiàn)于兒科、燒傷和休克等患者。為了確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，做好分析前質(zhì)量控制，目前常用的處理措施是通知臨床重新采集合格標(biāo)本送檢。但對(duì)患者進(jìn)行重新采血不僅加劇了患者的痛苦，更耽誤了檢測(cè)的時(shí)間，極有可能造成患者病情的延誤。而血常規(guī)檢測(cè)作為臨床診斷的基本項(xiàng)目之一，其使用的EDTA-K2抗凝血也最為常見(jiàn)，在枸櫞酸鈉抗凝血標(biāo)本不合格的情況下，其是否可替代用于凝血功能檢查為本研究的主要內(nèi)容。由表2可知，EDTA-K2抗凝血所測(cè)得的PT、APTT、TT和ATⅢ與枸櫞酸鈉抗凝血檢測(cè)結(jié)果之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其Fib、D-D、FDP的差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與方曉琳等[15]的研究結(jié)果一致。究其原因，不同抗凝劑對(duì)凝血功能檢測(cè)結(jié)果的影響，主要是由其各自的作用機(jī)制不同所造成。血液在離體后會(huì)迅速發(fā)生變化，其中許多凝血因子變得很不穩(wěn)定。枸櫞酸鈉作為鈣離子的快速螯合劑，不僅可與血液中鈣離子結(jié)合形成可溶性螯合物，從而有效地阻止血液凝固，并且能夠保護(hù)Ⅴ因子和Ⅷ因子的活性，因此109 mmol/L的枸櫞酸鈉被指定為凝血項(xiàng)目的專用抗凝劑[16]。EDTA-K2則主要與血液中鈣離子結(jié)合成螯合物以阻止血液凝固，但對(duì)凝血因子的保護(hù)性相對(duì)較差，因此會(huì)導(dǎo)致PT、APTT、TT延長(zhǎng)，ATⅢ活性增高，而對(duì)Fib、D-D、FDP的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯影響[17]。由此可見(jiàn)，臨床上測(cè)定PT、APTT、TT和ATⅢ時(shí)必須采用109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，而進(jìn)行Fib、D-D和FDP檢測(cè)時(shí)，則可用EDTA-K2抗凝。

綜上所述，影響凝血功能檢測(cè)結(jié)果的因素很多，因此要求檢驗(yàn)人員在檢測(cè)的全過(guò)程中都必須予以注意。在明確各影響因素的前提下，嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行檢測(cè)，本著最大程度為患者著想的原則，盡量減輕患者痛苦，保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

[1]陸明清,石展鷹,盧丹華.凝血功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響因素和質(zhì)量控制[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2010,17(2):155-156.

[2]董菊子,胡秦妮,楊淑娟,等.標(biāo)本放置和離心時(shí)間對(duì)PT、APTT檢測(cè)結(jié)果的影響[J].臨床軍醫(yī)雜志,2013,41(4):400-401.

[3]楊輔直,李偉生,蘇格炘,等.危重新生兒凝血功能障礙與DIC及其適時(shí)干預(yù)的臨床觀察[J].廣東醫(yī)學(xué)雜志,2009,30(9):1360-1362.

[4]Tripodi A,Caldwell SH,Hoffman M,et al.Review article:the prothrombin time test as a measure of bleeding risk and prognosis in liver disease[J].Aliment Pharmacol Ther,2007,26(2):141-148.

[5]Jae JK,Hui NP,Jin KJ,et al.Safety and convenience of continuous warfarin strategy during the periprocedural period in patients who underwent catheter ablation of atrial fibrillation[J].J Cardiovas Electrophysiol,2010,21(6):620-625.

[6]吳家明.肝實(shí)質(zhì)損害患者凝血、抗凝和纖溶指標(biāo)檢測(cè)及臨床意義[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2007,22(6):463．

[7]羅春華.凝血功能四項(xiàng)、TF、ATⅢ對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷意義[J].社區(qū)醫(yī)學(xué)雜志,2011,9(12):3-4.

[8]Mehrdad A,Henry A，Schnaars,et al.Determination of plasma fibrinogen concentrations in beagle dogs,cynomolgus monkeys,new zealand white rabbits,and sprague-dawley rats by using clauss and prothrombin-time-derived assays[J].J Am Assoc Lab Anim Sci,2011,50(6):864-867.

[9]黃培榮.血液流變學(xué)與凝血功能檢測(cè)對(duì)預(yù)防腦血栓的臨床意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2013,10(6):702-703.

[10]Di Nisio M,Squizzato A,Rutjes AW,et al.Diagnostic accuracy of D-dimer test for exclusion of venous thromboembolism:a systematic review[J].J Thromb Haemost,2007,5(2):296-304.

[11]高長(zhǎng)鳳.PT、APTT試驗(yàn)的影響因素[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生雜志,2005,21(24):3363-3364.

[12]朱忠勇.凝血功能測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,2006,21(5):308.

[13]Watanabe Y,Kawahara Y,Hanada D,et al.Examination of the sample centrifugation time for emergency coagulation test[J].Rinsho Byori,2012,60(11):1035-1039.

[14]丁立新,張晉敏,趙春娥.影響凝血實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性因素分析[J].河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2012,14(5):634-635.

[15]方曉琳,黎永新,馬潔.兩種抗凝劑對(duì)凝血三項(xiàng)測(cè)定結(jié)果的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)院雜志,2007,7(6):79-80.

[16]宋紅寶,徐建華,孔繁軍.血凝試驗(yàn)需要注意的問(wèn)題[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2012,10(17):679-680.

[17]李圃.抗凝劑差異與凝血酶原時(shí)間關(guān)系探討[J].華西醫(yī)學(xué),2008,23(4):752-754.

Influence of different centrifugation conditions and anticoagulants on detection results of coagulation function

ZUOCan1,WANGYan-lan1,LIHai-ying2,QINGZhi-ju1△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,XiangyaSecondHospitalofCentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410011,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,FirstHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha,Hunan410007,China)

Objective To explore the influence of different centrifugal conditions and anticoagulants on the detection results of blood coagulation function.Methods The prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT),thrombin time(TT),antithrombin Ⅲ(ATⅢ),fibrinogen(Fib),D-dimer(D-D) and fibrin degradation products (FDP) by STA-R type full automatic blood coagulation analyzer,which were detected by adopting different centrifugal speeds and time and two different kinds of anticoagulant.Results Compared with the detection results in the 3 000 r/min 10 min centrifugation group,the blood coagulation function test results had statistically significant differences among other centrifugal condition groups (P<0.05),except PT,TT,ATⅢ and Fib in the 3 000 r/min 5 min centrifugation group had no statistical differences(P>0.05).Compared with the detection results of sodium citrate anticoagulation,the anticoagulation by using ethylenediamine tetraacetic acid dipotassium(EDTA-K2) prolonged PT,APTT,TT and increased the ATⅢ activity(P<0.05),while Fib,D-D and FDP had no statistical differences(P>0.05).Conclusion The best centrifugal condition for blood coagulation function detection is 3 000 r/min centrifuging for 10 min,and in the determination of Fib,D-D and FDP,EDTA-K2anticoagulation can replace,while the others must use sodium citrate anticoagulation.

coagulation function; centrifugal conditions; sodium citrate; ethylenediamine tetraacetic acid dipotassium

左燦，女，在讀碩士，檢驗(yàn)技師，主要從事臨床生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究。△

，E-mail:zuocan12@sina.cn。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.030

A

1672-9455(2015)17-2560-03

2015-03-15

2015-04-10)