健康漢族孕婦GJB2基因突變產(chǎn)前篩查分析

李珊珊，王琳琳，呂 巍，楊樹(shù)法，于 璐

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院遺傳代謝實(shí)驗(yàn)室 100026)

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·論 著·

健康漢族孕婦GJB2基因突變產(chǎn)前篩查分析

李珊珊，王琳琳，呂 巍，楊樹(shù)法，于 璐

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院/北京婦幼保健院遺傳代謝實(shí)驗(yàn)室 100026)

目的 確定健康漢族孕婦的GJB2基因突變產(chǎn)前篩查。方法 對(duì)475例研究對(duì)象基因組DNA提取，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，基因芯片檢測(cè)GJB2、GJB3、SLC26A4及線粒體12S rRNA 4個(gè)基因9個(gè)位點(diǎn)；直接測(cè)序檢測(cè)其GJB2突變譜情況。結(jié)果 利用耳聾基因芯片，檢出15例研究對(duì)象攜帶6種致病突變，包括14例雜合突變：GJB2基因檢出3個(gè)框移突變，176-191 del 16、235del C和299-300del AT，35del G未檢出；SLC26A4基因檢出2個(gè)錯(cuò)義突變，2168A>G 和IVS7-2A>G；檢出1例線粒體12S rRNA 1555A>G純合型突變。直接測(cè)序法檢測(cè)整個(gè)GJB2編碼區(qū)，檢出176-191del 16、235del C、299-300del AT、109G>A 4種致病突變；79G>A、341A>G、478A>G和608T>C 4種多態(tài)性；11G>A、187G>T、372G>A、558G>A 4種未分類突變。其中211例研究對(duì)象至少攜帶1種GJB2突變，占檢測(cè)總數(shù)的44.4%。結(jié)論 該研究有助于孕婦產(chǎn)前耳聾基因突變的篩查分析，輔助孕婦遺傳性聽(tīng)力損失的遺傳咨詢。

突變頻率； GJB2基因突變； 遺傳性耳聾

聽(tīng)力障礙是一種常見(jiàn)的疾病，發(fā)生率1∶1 000，多方面原因可造成耳聾，其中50%～60%與遺傳因素有關(guān)[1]。70%遺傳性耳聾被認(rèn)為是非綜合征性耳聾(NSHI)，特點(diǎn)是只有聽(tīng)力損失，不伴有其他臨床癥狀[2]。NSHI具有高度的遺傳異質(zhì)性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了較深入研究，不斷地定位新的耳聾基因位點(diǎn)和克隆新的耳聾基因。GJB2基因是最常見(jiàn)的NSHI突變基因，主要引起先天性重度、極重度感音神經(jīng)性耳聾[2]。本研究通過(guò)對(duì)475例健康孕婦GJB2基因進(jìn)行產(chǎn)前篩查，初步分析健康孕婦人群耳聾基因突變情況，并報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 475例血標(biāo)本均來(lái)自2012年12月至2013年5月本院門診健康孕婦；年齡19～40歲，平均30.2歲；漢族。標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查問(wèn)卷自我測(cè)評(píng)均無(wú)聽(tīng)力損失。標(biāo)本2～8 ℃保存。

1.2 儀器與試劑 全血DNA提取試劑盒(天根生物)，遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)試劑盒(博奧生物有限公司)；PCR儀(博日公司)；芯片雜交儀、芯片掃描儀、芯片洗干儀(博奧生物有限公司)；ABI 3100 DNA測(cè)序儀(PE公司)。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取 取EDTA抗凝靜脈血0.5 mL，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行全血DNA提取，DNA標(biāo)本-20 ℃保存。

1.3.2 耳聾基因芯片檢測(cè) 按照遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)研究對(duì)象的耳聾基因GJB2(35del G、176-191del 16、235del C和299-300del AT)，GJB3(538C>T)，線粒體DNA 12S rRNA(1494C>T、1555A>G)，SLC26A4(2168A>G和IVS7-2A>G)突變情況。

1.3.3 直接測(cè)序檢測(cè) 根據(jù)Genebank中標(biāo)準(zhǔn)GJB2序列(NM_004004)，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)測(cè)序引物，上游引物：5′-TGC TTG CTT ACC CAG ACT-3′，下游引物：5′-GGT TGC CTC ATC CCT CTC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL，體系中含有：100 ng基因組DNA，2.5 μL PCR緩沖液，1.25 mM MgCl2，1 mM dNTP，每個(gè)引物10 pmol，1 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)條件：37 ℃ 10 min，95 ℃預(yù)變性5 min，后以95 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s和72 ℃延伸30 s，以此重復(fù)33個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。應(yīng)用ABI3100 DNA測(cè)序儀，利用以上引物進(jìn)行正反向雙向測(cè)序。應(yīng)用NCBI BLAST比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 95%可信區(qū)間比較本研究中檢測(cè)出的突變頻率與其他亞洲人群突變頻率的差異。

2 結(jié) 果

2.1 GJB2基因突變結(jié)果 采用耳聾基因芯片檢測(cè)技術(shù)檢出11例GJB2基因突變，包括1例176-191del 16，6例235del C，4例299-300del AT突變；35del G未檢出，見(jiàn)表1。475例標(biāo)本中有211例檢出至少攜帶一種突變位點(diǎn)，突變頻率44.4%。檢出的4種致病突變中，除109G>A突變外，測(cè)序均與耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果一致。此外，通過(guò)測(cè)序技術(shù)檢出79G>A、341A>G、478A>G和608T>C 4種非致病性多態(tài)；79G>A和341A>G在本研究中等位基因頻率分別為25.68%和19.89%，是最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，見(jiàn)表2。對(duì)健康孕婦GJB2基因第2外顯子直接測(cè)序，檢出12個(gè)突變位點(diǎn)，包括4個(gè)致病突變(109G>A、176-191del 16、235del C、299-300del AT)，4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(79G>A、341A>G、478A>G、608T>C)，4個(gè)未分類突變位點(diǎn)(11G>A、187G>T、372G>A、558G>A)，見(jiàn)表3。11G>A、372G>A、558G>A和187G>T突變與遺傳性耳聾的相關(guān)性尚未明確，558G>A檢出2例，等位基因頻率0.42%。此外，299-300del AT突變位點(diǎn)在本研究中的突變頻率為0.42%。通過(guò)測(cè)序檢出在相同的等位基因同時(shí)出現(xiàn)一種或多種雜合突變，如[79G>A /wt]、[109G>A/341A>G]和[(79G>A+109G>A+341A>G)/wt]；在相同的等位基因同時(shí)出現(xiàn)純合、雜合突變，如[11G>A/11G>A]+[79G>A/341A>G]、[79G>A /79G>A]+[341A>G/wt]和[341A>G/341A>G]+[79G>A/wt]。

表1 475例健康孕婦GJB2基因突變耳聾基因芯片檢測(cè)結(jié)果分析

表2 GJB2基因突變直接測(cè)序檢測(cè)基因型結(jié)果分析

續(xù)表2 GJB2基因突變直接測(cè)序檢測(cè)基因型結(jié)果分析

注：*wt表示野生型。

表3 475例健康孕婦GJB2基因突變直接測(cè)序檢測(cè)結(jié)果分析

續(xù)表3 475例健康孕婦GJB2基因突變直接測(cè)序檢測(cè)結(jié)果分析

注：109G>A為致病性存在爭(zhēng)議；187G>T為有研究表明錯(cuò)義突變。

2.2 GJB3、線粒體12S rRNA和SLC26A4突變結(jié)果 GJB3基因538C>T、線粒體12S rRNA基因1494C>T突變位點(diǎn)未檢出，見(jiàn)表3。檢出1例線粒體12S rRNA基因1555A>G純合突變；1例SLC26A4基因2168A>G/雜合突變，2例IVS7-2A>G雜合突變，突變頻率分別為0.11%和0.21%。檢出2例樣本同時(shí)帶有GJB2和SLC26A4基因的位點(diǎn)突變，分別為：2168A>G/wt+79G>A/79G>A+341A>G/341A>G和 IVS7-2A>G/wt+79G>A/79G>A+341A>G/341A>G。

2.3 GJB2基因235del C在不同研究中的突變頻率 本研究235del C突變頻率為1.26%(95%CI,0.46～2.73)，與不同東亞國(guó)家健康人群中的235del C突變頻率相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 235del C突變?cè)诓煌瑬|亞國(guó)家健康人群中的突變頻率比較

3 討 論

遺傳性NSHI有高度的遺傳異質(zhì)性，本研究利用基因芯片對(duì)475例健康漢族孕婦遺傳性耳聾基因進(jìn)行產(chǎn)前篩查，檢出6.3%攜帶有GJB2基因突變，0.8%檢出帶有線粒體12S rRNA和SLC26A4基因突變，GJB3基因的538C>T基因突變未檢出。通過(guò)直接測(cè)序，475例孕婦中有211例檢測(cè)出至少攜帶一種GJB2致病突變和(或)多態(tài)，占44.4%。其中235del C雜合型突變9例，突變頻率1.26%，類似于韓國(guó)人群(1.11%)，但高于泰國(guó)人群(0.49%)，低于日本人群(1.65%)和中國(guó)臺(tái)灣人群(2.08%)，235del C突變頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。299-300del T突變主要發(fā)生在東亞地區(qū)[3,5]，其他地區(qū)突變頻率未見(jiàn)報(bào)道。本研究檢出4例299-300del AT雜合型突變，突變頻率為0.84%。檢出1例176-191del 16突變，且為雜合型突變，突變頻率0.21%。

等位基因109G>A與遺傳性NSHI的相關(guān)性一直存在爭(zhēng)議。Kelly在1998年首次報(bào)道109G>A為NSHI的基因多態(tài)性，僅在健康人群中檢出，突變頻率為0.5%[12]。后續(xù)報(bào)道109G>A作為一種致病突變以純合和(或)雜合突變的形式存在，在健康人群中沒(méi)有檢出或其檢出的突變頻率低于耳聾患者的突變頻率[13-14]。對(duì)東亞人群研究發(fā)現(xiàn)，109G>A與輕、中度聽(tīng)力損失相關(guān)；在中國(guó)、韓國(guó)、泰國(guó)的中度聽(tīng)力損失患者中檢出高于健康對(duì)照組[15-16]。本研究109G>A等位基因突變頻率為2.95%(28/950)，10例為雜合型突變，9例為純合型突變，19例均未檢出與其他突變類型結(jié)合的復(fù)合雜合突變。與部分文獻(xiàn)報(bào)道相矛盾，分析原因有以下幾點(diǎn)：第一，研究對(duì)象選擇存在偏倚，以往研究對(duì)照組中未包含109G>A純合型的正常聽(tīng)力者；第二，109G>A突變引起的中度聽(tīng)力損傷相對(duì)起病晚、病程進(jìn)程慢,而且109G>A突變引起的聽(tīng)力損傷的病理癥狀可能由其他基因或環(huán)境因素調(diào)控[14,17-18]；本研究中，109G>A純合型的研究對(duì)象還未表現(xiàn)出聽(tīng)力損傷的癥狀；第三，109G>A突變可能不是致病基因位點(diǎn)，與GJB2或其他基因上的等位基因發(fā)生連鎖不平衡作用，作者所觀察的耳聾臨床癥狀是109G>A突變跟隨著其他等位基因作用造成的，將在后續(xù)進(jìn)一步追蹤研究對(duì)象的聽(tīng)力情況。

79G>A、341A>G、478A>G和608T>C在本研究中均有檢出，79G>A、341A>G等位基因頻率分別為25.68%、19.89%，是最普遍的多態(tài)類型；檢出136例79G>A、341A>G純合/雜合突變，占28.6%。79G>A、341A>G彼此相關(guān)，易在同一個(gè)體中同時(shí)出現(xiàn)，而且一些功能研究發(fā)現(xiàn)，攜帶此突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，由于縫隙連接蛋白障礙而導(dǎo)致鈣離子轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙[16]。研究中還檢出11G>A、187G>T、372G>A、558G>A 4種未分類突變。11G>A在亞洲人群、非洲裔美國(guó)人群中突變頻率較低，與本研究等位基因突變頻率(2/950，0.21%)結(jié)果相似[18]。而以往研究中僅在耳聾患者檢出187G>T突變，有學(xué)者認(rèn)為更可能為致病性突變而不是非致病性多態(tài)[10]。以上多態(tài)性及未分類突變是否與遺傳性耳聾相關(guān)，還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

通過(guò)GJB2基因的直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)研究人群中109G>A突變、235del C突變和299-300del AT突變頻率分別為5.90%、1.26%和0.84%，是GJB2基因中較為普遍的致病突變類型。以往研究中學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)人群GJB2基因中，235del C突變和299-300del AT突變是突變率比較高的類型之一[10]。在健康人群中產(chǎn)前篩查檢出以上兩種突變，建議其進(jìn)行遺傳性耳聾遺傳咨詢，同時(shí)，配偶進(jìn)行相應(yīng)的遺傳性耳聾基因突變位點(diǎn)篩查，進(jìn)而分析胎兒是否攜帶相應(yīng)突變位點(diǎn)；而對(duì)于有聽(tīng)力損傷癥狀者，同時(shí)建議其直系親屬進(jìn)行相應(yīng)突變檢測(cè)，明確該遺傳因素對(duì)家族的影響。109G>A突變是否是致病突變還存在爭(zhēng)議，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其與中、輕度聽(tīng)力損失相關(guān)，也建議增加為產(chǎn)前篩查GJB2基因的突變位點(diǎn)[15]。

此外，通過(guò)耳聾芯片檢出1例線粒體12S rRNA 1555A>G純合型突變，此突變可引起氨基糖苷類致藥物性耳聾。該研究對(duì)象自評(píng)無(wú)聽(tīng)力損傷，自述未服用過(guò)此類藥物。因帶有該基因突變者，使用氨基糖苷類藥物后會(huì)造成雙側(cè)永久性聽(tīng)力損失，不使用則不發(fā)病，建議其在今后避免使用此類藥物。因其為母系遺傳的特點(diǎn)，同時(shí)建議其母系親屬進(jìn)行相應(yīng)突變檢測(cè)，明確該遺傳因素對(duì)家族的影響，避免使用此類藥物。

因以上突變?cè)谥袊?guó)漢族人群突變情況以及遺傳性耳聾對(duì)患者生活質(zhì)量的影響，對(duì)于分娩后的新生兒開(kāi)展遺傳性耳聾基因的篩查也尤為重要，并對(duì)攜帶致病突變的新生兒及其親屬進(jìn)行遺傳指導(dǎo)及婚育指導(dǎo)。

本研究通過(guò)直接測(cè)序法進(jìn)一步驗(yàn)證了耳聾芯片檢測(cè)以上4種致病基因的準(zhǔn)確性，為進(jìn)一步大范圍開(kāi)展耳聾芯片檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。作者在健康孕婦中檢測(cè)出遺傳性耳聾基因相關(guān)基因位點(diǎn)突變，其可能會(huì)增加下一代聽(tīng)力障礙的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步證明產(chǎn)前篩查遺傳性耳聾基因的重要性。進(jìn)行遺傳性耳聾基因的產(chǎn)前篩查，能夠?yàn)樵袐D提供早期健康的建議，阻止疾病進(jìn)展。

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Prenatal screening for mutations in GJB2 gene in healthy Han pregnant women

LIShan-shan,WANGLin-lin,LYUWei,YANGShu-fa,YULu

(GeneticMetabolismLaboratory,AffiliatedBeijingObstetricsandGynecologyHospitalCapitalMedicalUniversity/BeijingMaternalandChildHealthCareHospital,Beijing100026,China)

Objective To determinate the prenatal screening of mutations of the major deafness gene GJB2 in healthy Han pregnant women.Methods The gene DNA extraction and amplification was performed in 475 healthy Han pregnant women as the research subjects.9 loci of GJB2,GJB3,SLC26A4 and mitochondria12S rRNA were detected by the DNA microarray analysis.The direct DNA sequencing was used for detecting the GJB2 mutation situation.Results The deafness gene microarray analysis showed six types of pathogenic mutations in 15 research subjects,including 14 cases of heterozygous mutation:3 frameshift mutations in GJB2 gene,non-mutation was detected in 176-191 del 16,235del C and 299-300del AT,35del G;2 missense mutations in SLC26A4 gene,2168A>G and IVS7-2A>G;1 case of mitochondria12S rRNA 1555A>G homozygotic type mutation was detected out.The whole GJB2 coding region was detected by the direct DNA sequencing,including 4 kinds of detected pathogenic mutation 176-191del 16,235del C,299-300del AT and 109G>A,4 kinds of polymorphism 79G>A,341A>G,478A>G and 608T>C and 4 kinds of non-classification mutation11G>A,187G>T,372G>A and 558G>A.Among them,211 subjects carried at least 1 kind of GJB2 mutation,accounting for 44.4% of the detected total number.Conclusion This research is conducive to screening analysis of prenatal deafness gene mutation and assisted genetic counselling for hereditary hearing loss.

mutation frequency; GJB2 gene mutation; inherited deafness

李珊珊，女，碩士，主管技師，主要從事耳聾基因芯片檢測(cè)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.029

A

1672-9455(2015)17-2556-04

2015-03-25

2015-04-10)