原發(fā)性膽汁性肝硬化血清學(xué)抗體與戊型肝炎病毒抗體間的相關(guān)性分析

邢雪梅，李艷琴，沈 鋼，張 軍，祝力琦

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西漢中 723000)

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·論 著·

原發(fā)性膽汁性肝硬化血清學(xué)抗體與戊型肝炎病毒抗體間的相關(guān)性分析

邢雪梅，李艷琴，沈 鋼，張 軍，祝力琦

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬3201醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西漢中 723000)

目的 回顧性研究127例原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)相關(guān)血清學(xué)自身抗體與戊型肝炎病毒 (HEV) 抗體之間的相關(guān)性。方法 與PBC相關(guān)自身抗體：抗線粒體抗體M2亞型(AMA-M2)、重組M2融合蛋白抗體(M2-3E/BPO)、抗核點(diǎn)型靶抗原蛋白100 (抗-sp100)、抗核孔復(fù)合物210 跨膜糖蛋白抗體(抗-gp210)、抗著絲粒蛋白B抗體(CENP B)，以上抗體中單一或多抗體陽性血清127例與93例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者、92例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者和122例健康人血清樣本同期分別采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)HEV IgG/IgM抗體。結(jié)果 PBC相關(guān)自身抗體陽性組、健康人對(duì)照組、SLE和RA組的HEV-IgG抗體陽性率分別是55.9%、27.0%、23.7%、40.2%，經(jīng)χ2檢驗(yàn)PBC相關(guān)自身抗體陽性組與其他三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PBC相關(guān)單一自身抗體陽性組和多抗體陽性組之間HEV-IgG抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.319，P>0.05)。性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.281，P>0.05)。結(jié)論 PBC相關(guān)自身抗體陽性血清存在HEV抗體高陽性率。PBC相關(guān)自身抗體和HEV-IgG抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可能存在相互干擾。

原發(fā)性膽汁性肝硬化； 自身抗體； 戊型肝炎病毒抗體

原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種原因不明的以肝內(nèi)中、小膽管進(jìn)行性、非化膿性炎癥為特征，以慢性肝內(nèi)膽汁淤積為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病。戊型病毒性肝炎(HE)是由戊型肝炎病毒(HEV)感染導(dǎo)致的急性傳染病，主要經(jīng)消化道傳播，是我國乙類法定傳染病之一。一般認(rèn)為原發(fā)性膽汁性肝硬化和戊型肝炎是兩類獨(dú)立疾病，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)亦未見兩者的相關(guān)性報(bào)道。筆者在實(shí)驗(yàn)室工作中發(fā)現(xiàn)PBC相關(guān)自身抗體陽性血清存在HEV抗體高陽性率，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 PBC相關(guān)自身抗體陽性組：收集2010年8月至2014年7月在本院住院及門診就診的肝功能異?；颊吆妥≡夯颊叱Ｒ?guī)檢查抗核抗體(ANA)陽性者中，與PBC相關(guān)自身抗體AMA-M2和/或sp100、gp210及CENP B抗體陽性血清127例。其中男性23例，女性104例，男女比例為1∶5.5。年齡結(jié)構(gòu)：男性36～83(63.61±11.17)歲；女性33～84(58.74±11.35)歲。127例PBC相關(guān)自身抗體陽性血清中19例生化指標(biāo)正常，108例堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、總膽汁酸等生化指標(biāo)異常，排除甲、乙、丙肝炎病毒感染。對(duì)照組：同期選取系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者93例，其中男4例，女89例，平均年齡(35.02±13.95)歲。診斷符合SLICC和EULAR 2009年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者92例，其中男31例，女61例，平均年齡(53.03±12.96)歲。診斷符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[3-4]。以上兩組排除合并其他結(jié)締組織病。健康對(duì)照組：另取健康成人122例，來自健康體檢人群，男35例，女87例，平均年齡(49.36±9.65)歲。肝功能正常，排除結(jié)締組織病。三組均排除甲、乙、丙肝炎病毒感染。PBC相關(guān)自身抗體陽性血清與SLE、RA患者血清-80 ℃冰凍保存?zhèn)溆?，健康人為新鮮分離血清。

1.2 方法

1.2.1 間接免疫熒光法 檢測(cè)抗線粒體抗體(AMA)和抗核抗體(ANA)。采用德國歐蒙公司間接免疫熒光法試劑盒，ANA選用HEP-2細(xì)胞和猴肝兩種組織細(xì)胞基質(zhì)；AMA選用HEP-2、猴肝、猴心肌、猴髂腰肌、大鼠腎和大鼠胃6種組織細(xì)胞基質(zhì)。組織細(xì)胞的冰凍切片作為抗原，采用生物薄片技術(shù)組合成一個(gè)反應(yīng)區(qū)。待檢血清自1∶100(體積比)起稀釋，與組織細(xì)胞孵育30 min，加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG)抗體結(jié)合30 min，洗片、封片后奧林巴斯BX-51熒光顯微鏡觀察結(jié)果，出現(xiàn)特異性綠色熒光、血清稀釋度大于1∶100為陽性。

1.2.2 歐蒙印跡法 采用德國歐蒙免疫印跡試劑盒，免疫印跡膜條上事先包被丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(AMA-M2)、重組M2融合蛋白(BCOADC-E2 PDC-E2 OGDC-E2,M2-3E/BPO)、可溶性酸性磷酸化核蛋白(sp100)、核孔復(fù)合物210×103跨膜糖蛋白(gp210)、著絲粒蛋白B(CENP B)等純化抗原。實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑說明書使用歐蒙全自動(dòng)免疫印條儀EUROBlotMaster Ⅱ進(jìn)行操作，膜條自然干燥后用系統(tǒng)自帶EUROLineScan軟件判讀結(jié)果，根據(jù)條帶色度深淺反應(yīng)血清中抗體濃度。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn) 采用北京萬泰生物藥業(yè)有限公司診斷試劑盒(同批號(hào))，間接法檢測(cè)戊型肝炎病毒IgG抗體；捕獲法檢測(cè)戊型肝炎病毒IgM抗體。帝肯Sunrise全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各反應(yīng)孔吸光度(A)值，以樣品A值大于或等于臨界值(HEV-IgG臨界值cut off=0.16+陰性對(duì)照孔A值均值，HEV-IgM臨界值cut off=0.26+陰性對(duì)照孔A值均值)者為HEV-IgG/IgM抗體有反應(yīng)性。同期使用北京萬泰診斷試劑盒檢測(cè)甲、乙、丙肝炎病毒抗體，試驗(yàn)步驟及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照試劑說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組抗體陽性率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平取α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PBC相關(guān)自身抗體陽性組和健康人群、SLE組、RA組的HEV抗體陽性率 127例PBC相關(guān)自身抗體陽性組中HEV抗體陽性71例(55.9%，其中HEV-IgG抗體陽性69例，2例HEV-IgG/IgM抗體均陽性)。122例健康人中HEV-IgG抗體陽性33例(27.0%)。93例SLE中HEV-IgG抗體陽性22例(23.7%)。92例RA中HEV-IgG抗體陽性37例(40.2%)，對(duì)照各組HEV-IgM抗體均陰性。經(jīng)χ2檢驗(yàn)PBC抗體陽性組與其他三組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組HEV抗體陽性率[n(%)]

注：與PBC抗體陽性組比較，χ2=21.303，aP=0.000；χ2=22.881，bP=0.000；χ2=5.253；cP=0.022。

2.2 PBC相關(guān)單一抗體陽性組與多抗體陽性組間HEV抗體陽性率 PBC相關(guān)單一抗體陽性組：患者血清中僅存在AMA-M2(和/或M2-3E/BPO)、gp210、sp100三者之一的共69例(CENP B抗體單一陽性的不在127例統(tǒng)計(jì)范圍)，其中HEV抗體陽性37例(53.6%，HEV-IgG抗體陽性36例，1例HEV-IgG/IgM抗體均陽性)。多抗體陽性組：患者血清中同時(shí)存在AMA-M2(和/或M2-3E/BPO)、GP210、sp100、CENPB 4種抗體中的兩種或兩種以上的58例，HEV抗體陽性34例(58.6%，HEV-IgG抗體陽性33例，1例HEV/IgM抗體均陽性)。兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.572>0.05)，見表2。

表2 PBC相關(guān)單一/多抗體陽性組間HEV

注：與PBC相關(guān)單一抗體陽性組比較，χ2=0.319，aP=0.572。

2.3 不同性別PBC相關(guān)自身抗體陽性組患者的HEV抗體陽性率比較 127例PBC相關(guān)自身抗體陽性組患者中女性104例，其中57例HEV抗體陽性(54.8%，HEV-IgG抗體陽性56例，1例HEV-IgG/IgM抗體均陽性)。23例男性患者中14例HEV抗體陽性(60.9%，HEV-IgG抗體陽性13例，1例HEV-IgG/ IgM抗體均陽性)。兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.596>0.05)，見表3。

表3 不同性別PBC相關(guān)自身抗體陽性組患者的

注：與PBC抗體陽性組男性患者的HEV-IgG抗體陽性率比較，χ2=0.281，aP=0.596。

3 討 論

HEV是HE的病原體，多見于青壯年男性，主要通過糞-口途徑經(jīng)腸道傳播，即可引起暴發(fā)流行，也可呈散發(fā)，我國是戊型肝炎的流行區(qū)。戊型肝炎的診斷依據(jù)包括流行病學(xué)史、臨床癥狀和體征以及實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)。其中病原學(xué)檢測(cè)異常重要，HEV-IgM陽性、HEV-IgG陽性或含量4倍及以上升高，血清和(或)糞便HEV-RNA陽性，3項(xiàng)指標(biāo)的任何一項(xiàng)陽性都可作為HEV急性感染的臨床診斷依據(jù)，如同時(shí)2項(xiàng)指標(biāo)陽性則可確診[4]。HEV-IgM在患者出現(xiàn)癥狀時(shí)大多能檢出，恢復(fù)期迅速消退。IgG抗體緊隨IgM抗體出現(xiàn)且濃度迅速升高，并將持續(xù)數(shù)十年。本次試驗(yàn)中僅2例HEV-IgM陽性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，本文著重探討PBC相關(guān)自身抗體陽性血清中HEV-IgG陽性率。

PBC是一種慢性自身免疫性肝臟疾病，多見于中老年女性，初起時(shí)可無癥狀或癥狀隱匿，病情進(jìn)展個(gè)體差異大，易于誤診。隨著國內(nèi)外對(duì)該病研究和診斷技術(shù)的不斷提高，PBC 在我國肝病患者中的檢出率也逐漸提高。PBC患者血清中可出現(xiàn)多種特征性自身抗體，本次納入研究的4種自身抗體均是PBC患者血清中的較特異抗體，這些自身抗體的檢出對(duì)該病發(fā)病機(jī)制、診斷、治療及預(yù)后均有重要意義。2009年美國肝病學(xué)會(huì)(AASLD)與2010年歐洲肝病研究學(xué)會(huì)(EASL)推薦的PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)中，AMA-M2已直接作為PBC的一個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5-6]。并且高滴度的AMA可在PBC臨床表現(xiàn)、生化指標(biāo)和組織學(xué)改變之前就出現(xiàn)。Jiang等[7]研究發(fā)現(xiàn)抗M2-3E/BPO在PBC的診斷中敏感度與特異度分別為80.2%和98.8%，與AMA-M2聯(lián)合檢測(cè)陽性預(yù)測(cè)值可達(dá)62.5%?？?gp210抗體陽性的患者有更嚴(yán)重的膽汁淤積和肝功能損害，提示預(yù)后不佳?？?sp100對(duì)診斷PBC特異性高達(dá)94%，尤其對(duì)AMA陰性PBC患者，并且更易出現(xiàn)在老年人[8-9]。本次統(tǒng)計(jì)CENP B合并上述3種抗體的17例，約占13.4%，與王雪松和李永哲[10]報(bào)道抗著絲點(diǎn)抗體陽性率在PBC約為12.14%相近。127例血清中70例ANA陽性，主要是核膜型(抗-gp210)、核點(diǎn)型(抗-sp100)和著絲點(diǎn)型(CENP B)，約占55.1%，與閆惠平等[11]報(bào)道有50%PBC患者ANA陽性率相近。本次研究中上述抗體無論單一抗體陽性還是合并多抗體陽性，雖然在PBC中表現(xiàn)的臨床意義不盡相同，但在血清HEV抗體檢測(cè)中均呈現(xiàn)較高的陽性率。

目前國內(nèi)外HEV血清學(xué)檢測(cè)試劑的質(zhì)量差別較大，但本試驗(yàn)使用的北京萬泰ELISA診斷試劑盒陽性和陰性總符合率最高，也被用作試劑質(zhì)量考核的參比試劑[12-14]。試驗(yàn)中PBC相關(guān)自身抗體陽性組HEV抗體陽性病例為71例，其中 38例以SS、SLE、RA、間質(zhì)性肺炎、蛋白尿等疾病就診，31例以肝功能異常原因待查入院。另2例HEV-IgM/IgG均陽性患者，1例為十二指腸球部潰瘍穿孔，1例為心包積液、高血壓病就診。所有病例均非戊型肝炎就診，流行病學(xué)調(diào)查及臨床癥狀和體征亦不支持戊型肝炎診斷(因是回顧性研究未做雙份HEV-IgG抗體檢測(cè)和HEV-RNA檢測(cè))。而PBC相關(guān)自身抗體AMA-M2、gp210、sp100及CENP B滴度均大于或等于1∶1 000(歐蒙滴度)，是否高滴度PBC相關(guān)自身抗體的陽性可引起ELISA 檢測(cè)HEV抗體試驗(yàn)假陽性，相反，HEV抗體的存在是否可以造成PBC相關(guān)自身抗體的滴度增高[15]。

試驗(yàn)組選取了同期臨床確診的SLE和RA患者血清設(shè)置對(duì)照組。SLE、RA患者血清均存在高滴度的自身抗體，其中ANA≥1∶1 000(歐蒙滴度)；ds-DNA(抗雙鏈DNA抗體)、AKA(抗角蛋白抗體)≥1∶10(歐蒙滴度)；CCP(抗環(huán)瓜氨酸肽抗體)≥20 U/mL(正常參考0～5 U/mL，德國歐蒙ELISA檢測(cè)試劑盒)；類風(fēng)濕因子(RF)-IgG≥150 U/mL(正常參考0～20 U/mL，德國歐蒙ELISA檢測(cè)試劑盒)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SLE及RA組HEV抗體陽性率并沒有表現(xiàn)增高趨勢(shì)。盡管RA組HEV抗體陽性率略高，但與PBC組間差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，分析認(rèn)為與RF因子為變性IgG干擾ELISA有關(guān)[15]。

本組數(shù)據(jù)表明在不同性別間HEV抗體的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。127例血清中男女性別比為1∶5.5，與既往國內(nèi)報(bào)道PBC性別比1∶8～1∶10有差異，可能本研究僅是抗體陽性而非PBC確診病例，樣本量也有限，或是存在地區(qū)差異，男性所占比例偏大可能造成HEV抗體陽性比例增高，尚需擴(kuò)大樣本。

通過本次試驗(yàn)證明，PBC相關(guān)自身抗體陽性血清存在HEV抗體高陽性率，目前國內(nèi)外鮮有報(bào)道。PBC發(fā)病率低，樣本量積累有限，目前僅通過小樣本回顧性研究PBC相關(guān)自身抗體與HEV-IgG間關(guān)聯(lián)，也可能是由于存在試驗(yàn)方法之間的干擾，還需繼續(xù)復(fù)習(xí)臨床資料，擴(kuò)大樣本，結(jié)合組織病理學(xué)，尋求兩者間是否相關(guān)的依據(jù)。

[1]Schneider M.EULAR recommendations for the management of systemic lupus erythematosus[J].Z Rheumatol,2009,68(7):578-583.[2]Amezcua-Guerra LM,Higuera-Ortiz V,Arteaga-Garcia U,et al.Performance of the 2012 SLICC and the 1997 ACR classification criteria for systemic lupus erythematosus in a real-life scenario[J].Arthritis Care Res (Hoboken),2014,29(6)：833-836.

[3]Aletaha D,Neogi T,Silman AJ,et al.2010 Rheumatoid arthritis classification criteria:an American college of rheumatology/European league against rheumatism collaborative initiative[J].Arthritis Rheum,2010,62(9):2569-2581.

[4]Zhang J,Li SW,Wu T,et al.Hepatitis E virus:neutralizing sites,diagnosis,and protective immunity[J].Rev Med Virol,2012,22(5):339-349.

[5]Lindor KD,Gershwin ME,Poupon R,et al.Primary biliary cirrhosis[J].Hepatology,2009,50(1):291-308.

[6]EASL Clinical Practice Guidelines.Management of cholestatic liver diseases[J].J Hepatol,2009,51(2):237-267.

[7]Jiang XH,Zhong RQ,Yu SQ,et al.Construction and expression of a humanized M2 autoantigen trimer and its application in the diagnosis of primary biliary cirrhosis[J].World J Gastroenterol,2003,9(6):1352-1355.

[8]Muratori P,Muratori L,Cassani F,et al.Anti-multiple nuclear dots (anti-MND) and anti-SP100 antibodies in hepatic and rheumatological disorders[J].Clin Exp Immunol,2002,127(1):172-175.

[9]Granito A,Muratori P,Quarneti C,et al.Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis[J].Expert Rev Mol Diagn,2012,12(1):65-74.

[10]王雪松,李永哲.原發(fā)性膽汁性肝硬化自身抗體譜研究進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2006,3(14):245-249.

[11]閆惠平,莊輝,劉燕敏,等.原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的免疫學(xué)特點(diǎn)分析[J].中華肝臟病雜志,2005,1(13):12-16.

[12]周誠,黃維金,姚昕,等.幾種戊型肝炎試劑的比較及IgG抗體定量方法的建立[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2009,9(29):854-857.

[13]江永珍,田瑞光,魯建,等.我國戊型肝炎ELISA診斷試劑的質(zhì)量比較[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志,2007,1(21):59-61.

[14]李宏峰,趙紅.戊型肝炎病毒抗體檢測(cè)試劑盒臨床考核數(shù)據(jù)分析[J].世界華人消化雜志，2009,34(17):3550-3552.

[15]Kragstrup TW,Vorup-Jensen T,Deleuran B,et al.A simple set of validation steps identifies and removes false results in a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay caused by anti-animal IgG antibodies in plasma from arthritis patients[J].Springerplus,2013,2(1):263-270.

Correlation between serological antibody and hepatitis E virus antibody in primary biliary cirrhosis

XINGXue-mei,LIYan-qin,SHENGGang,ZHANGJun,ZHULi-qi

(DepartmentofClinicalLaboratory,Affiliated3201Hospital,MedicalCollegeofXi′anJiaotongUniversity,Hanzhong,Shaanxi723000,China)

Objective To retrospective study the correlation between serological antibody and hepatitis E virus(HEV) antibody in 127 cases of primary biliary cirrhosis (PBC).Methods 127 cases of single or multiple PBC related autoantibody positive serum samples,including anti-mitochondrial antibodies-M2 (AMA-M2),anti-BCOADC-E2 PDC-E2 OGDC-E2(M2-3E/BPO),anti-sp100 antibodies (anti-sp100),anti-gp210 antibodies (anti-gp210),anti-centromere-associated proteins B (CENP B),were detected the IgG and IgM antibody of HEV by ELISA.Meanwhile 93 cases of systemic lupus erythematosus(SLE),92 cases of rheumatoid arthritis(RA) and 122 healthy adult serum simples were selected as control group for detecting HEV-IgG/IgM antibody.Results The seroprevalence of HEV-IgG antibody in the PBC group,healthy adults control group,SLE and RA groups were 55.9%,27.0%,23.7% and 40.2% respectively.The statistically significant difference between PBC group and other three groups was noticed(P<0.05).It demonstrated no significant difference between PBC related single-antibody positive group and multi-antibody positive group(χ2=0.319，P>0.05). No sex difference was found (χ2=0.281，P>0.05).Conclusion The high seroprevalence of HEV-IgG antibody exists in the PRB related autoantibody positive serum.There may be mutual interference between PBC related autoantibody and HEV-IgG antibody.

primary biliary cirrhosis； autoantibody； hepatitis E virus antibody

邢雪梅，女，本科，主治醫(yī)師，主要從事自身免疫疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.023

A

1672-9455(2015)17-2540-03

2015-02-25

2015-05-17)