改良血栓栓塞法建立家兔腦血栓模型的實(shí)驗(yàn)研究*

堯雪洲，李國(guó)暉，楊 燕，許 軔

(1.云南中醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科,昆明 650021;3.云南藝術(shù)學(xué)院圖書(shū)館,昆明 650500)

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·論 著·

改良血栓栓塞法建立家兔腦血栓模型的實(shí)驗(yàn)研究*

堯雪洲1，李國(guó)暉2，楊 燕2，許 軔3

(1.云南中醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室,昆明 650500；2.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科,昆明 650021;3.云南藝術(shù)學(xué)院圖書(shū)館,昆明 650500)

目的 采用改良的血栓栓塞法建立家兔腦血栓模型，并引入CT技術(shù)等對(duì)模型進(jìn)行觀察與評(píng)價(jià)。方法 將12只家兔隨機(jī)分為偽手術(shù)組和建模組兩組，導(dǎo)管自家兔頸外動(dòng)脈逆行至頸內(nèi)動(dòng)脈，偽手術(shù)組注入生理鹽水，建模組借助導(dǎo)絲注入經(jīng)過(guò)體外處理的線狀長(zhǎng)血栓；術(shù)前與術(shù)后行CAT檢查對(duì)照，并于術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)觀察行為障礙評(píng)分及頭顱NCCT測(cè)量CT值進(jìn)行對(duì)照。結(jié)果 建模組手術(shù)前后相比較，術(shù)后4 h CTA顯示建模組6例均成功置入自頸內(nèi)動(dòng)脈中段至大腦中動(dòng)脈的血栓子；術(shù)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分及顱腦NCCT檢查，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 該模型簡(jiǎn)便易行，血栓位置穩(wěn)定，血栓成分與臨床類(lèi)似，對(duì)動(dòng)物損傷相對(duì)較小，重復(fù)性好，是一種較為理想的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦血栓模型。

腦血栓模型； 血栓栓塞法； 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型

建立一種栓塞位置比較穩(wěn)定、能模擬人類(lèi)腦血栓的動(dòng)物模型，對(duì)腦血栓類(lèi)疾病、溶栓治療、出血相關(guān)因素及超過(guò)溶栓時(shí)間窗治療的研究具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)研究及借鑒了目前流行的制作方法，并對(duì)建模方法及模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行了改進(jìn),得到了一個(gè)易于觀察評(píng)價(jià)，栓塞部位及梗死范圍穩(wěn)定的家兔腦血栓模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料 家兔12只，雌雄不限，體質(zhì)量(2.0±0.3)kg，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(滇)K2011-0011。術(shù)前10 h禁食，5 h禁飲。編號(hào)后隨機(jī)抽號(hào)分為2組，即偽手術(shù)組(1組)與建模組(2組)。

1.2 儀器與試劑 GE Light Speed 128層螺旋CT，西門(mén)子公司生產(chǎn)；高溫消毒鍋，型號(hào)LDZX-50KBS，上海申安公司生產(chǎn)；一次性麻醉導(dǎo)管，貴州天地藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；靜脈留置針，型號(hào)32A,德國(guó)貝朗公司生產(chǎn)；恒溫箱；金屬銀導(dǎo)絲；麻醉喉鏡，兒童型；一次性氣管插管，3.5號(hào)；烏拉坦，百塞勤化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司生產(chǎn)(批號(hào)20120308)；造影劑碘海醇注射液(歐乃派克350 mg/L)，美國(guó)GE公司生產(chǎn)；注射用青霉素鈉，中諾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；凝血酶Thrombin,品牌sigma。

1.3 方法

1.3.1 建模手術(shù) 兔耳緣靜脈緩慢注射烏拉坦1 mg/kg(25%,4 mL/kg)麻醉。麻醉后將家兔呈頭部過(guò)仰臥位固定在兔手術(shù)臺(tái)上，在麻醉喉鏡輔助下氣管插管。手術(shù)部位備皮，消毒鋪巾后取頸前正中切口，于下頜角內(nèi)側(cè)舌骨水平分離出右頸總動(dòng)脈(CCA)，切斷該側(cè)舌骨肌，于頸動(dòng)脈膨大處分離頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)，結(jié)扎ECA各分支；CCA近心端及ICA遠(yuǎn)心端用動(dòng)脈夾阻流，自頸ECA逆行插管至CCA內(nèi)。取血1 mL；將血液加入抗凝劑適量后放入恒溫箱內(nèi)老化10 min，制成約長(zhǎng)10.0 mm、直徑0.2 mm的自體血栓；絲線牽拉ECA向下以減小ECA與ICA的夾角(形成鈍角)，小心地插入套管大約35 mm(從頸總動(dòng)脈分叉處計(jì)算),此時(shí)套管頭端距離大腦中動(dòng)脈(MCA)起始處2～3 mm，盡量接近MCA起始。建模組借助金屬銀導(dǎo)絲注入自體血栓，偽手術(shù)組注入生理鹽水。術(shù)畢逐層縫合，肌注青霉素(40萬(wàn)單位/只)。

1.3.2 CTA造影 術(shù)后4 h對(duì)建模組與偽手術(shù)組所有家兔行頭頸部血管CT血管造影(CTA)，并進(jìn)行對(duì)比。成像方案為家兔麻醉仰臥位，碘海醇注射液(歐乃派克350 mg/L)，耳緣靜脈直接注入，劑量12～16 mL(約4.9～6.6 mL/Kg)，灌注后70 s的延時(shí)掃描(DCT)，CT全腦灌注成像(PWCT)作為CTA源圖重建CTA，判斷顱內(nèi)大血管阻斷或狹窄及分支缺損情況。

1.3.3 行為障礙評(píng)分 參考Langa和Bederson的方法，改良后的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：滿分為12分,分?jǐn)?shù)越高,動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。于術(shù)前及術(shù)后8、12 h對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)分。計(jì)分規(guī)則如下:(1)家兔至地面，觀察其行走情況。行為完全正常者，記0分；無(wú)神經(jīng)損傷癥狀0分；向手術(shù)對(duì)側(cè)傾斜者記1分；向?qū)?cè)傾倒2分；損傷嚴(yán)重，已無(wú)法自主活動(dòng)者記3分；昏迷、意識(shí)喪失4分。(2)將動(dòng)物置于平地面上，分別推雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)；觀察兩側(cè)抵抗力有無(wú)差異；檢查阻力；觀察兩前肢的肌張力。如雙側(cè)阻力對(duì)等且有力,計(jì)為0分；如向手術(shù)對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降者，根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重3度,分別計(jì)為1、2、3分；昏迷、意識(shí)喪失4分。(3)提家兔后肢離開(kāi)地面約1尺，將動(dòng)物兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察兩前肢屈曲情況：如雙前肢對(duì)稱伸向地面,計(jì)為0分。對(duì)側(cè)有前肢內(nèi)收或肩內(nèi)旋者，記1分;不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪 2分；既有腕、肘的屈曲又有肩內(nèi)旋不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪者計(jì)3分，昏迷4分。

1.3.4 頭顱NCCT 術(shù)前及術(shù)后12 h所有家兔(仰臥位)采用顱腦常規(guī)非強(qiáng)化CT(NCCT，Noncontrast CT)。掃描方案為：電流100～400 mV，自顱底區(qū)向上掃描至顱頂，層厚1.25 mm，電壓100 kV，掃描時(shí)間3.34 s。3名放射科高年資醫(yī)師，按照Alberta Stroke Program Early CT Score (ASPECTS)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行大腦中動(dòng)脈供血區(qū)分析。ASPECTS分區(qū)的每個(gè)區(qū)域分別按照影像學(xué)表現(xiàn)分為正常區(qū)、腦質(zhì)密度降低區(qū)和水腫區(qū)。分別測(cè)量建模組梗死灶及偽手術(shù)組相對(duì)應(yīng)區(qū)CT值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.00生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。兩實(shí)驗(yàn)組術(shù)前顱腦NCCT值，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；兩實(shí)驗(yàn)組術(shù)后8、12 h生物學(xué)行為評(píng)分?jǐn)?shù)據(jù)及術(shù)前與術(shù)后12 h NCCT測(cè)量的CT值均采用了多組重復(fù)測(cè)量資料的方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建模前、后家兔頭頸部CTA結(jié)果

2.1.1 術(shù)前CTA對(duì)家兔頭頸部血管的觀察 主動(dòng)脈弓造影顯示家兔的弓上血管呈2分支結(jié)構(gòu)，左右側(cè)頸總動(dòng)脈與鎖骨下動(dòng)脈起始部共干。術(shù)前家兔CTA結(jié)果表明，家兔的頭頸血管結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，本次實(shí)驗(yàn)中未見(jiàn)明顯變異結(jié)構(gòu)，與人類(lèi)頭頸部血管結(jié)構(gòu)具有較好相似性和可比性。見(jiàn)圖1。

2.1.2 建模手術(shù)后4 h CTA結(jié)果 血栓栓塞組6例均顯示頸內(nèi)動(dòng)脈明顯狹窄，頸內(nèi)動(dòng)脈內(nèi)至大腦中動(dòng)脈內(nèi)有血栓形成。該結(jié)果提示，術(shù)后4 h，經(jīng)過(guò)手術(shù)植入的血栓子穩(wěn)定，未溶解，未見(jiàn)出血等其他并發(fā)癥。見(jiàn)圖2。

圖1 CTA術(shù)前顯示家兔頭頸部血管

圖2 CTA顯示建模后家兔血栓栓塞

2.2 行為學(xué)障礙評(píng)分結(jié)果

2.2.1 術(shù)前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為障礙評(píng)分兩組均為0分，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 術(shù)后8、12 h兩組家兔行為學(xué)評(píng)分

2.2.2 術(shù)后8、12 h，家兔蘇醒后均表現(xiàn)出不同程度行為障礙。Mauchly的球形度檢驗(yàn)，不拒絕球形假設(shè)(P=0.687)；不同時(shí)間行為學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)；動(dòng)物分組處理因素與時(shí)間的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)；動(dòng)物分組處理差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。該結(jié)果提示，在不同處理組間，不同觀察點(diǎn)觀察，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 術(shù)前及術(shù)后12 h NCCT頭顱平片的變化

2.3.1 術(shù)前顱腦NCCT，兩組12只家兔雙側(cè)CT圖像腦組織均勻?qū)ΨQ，術(shù)前CT值均值約為(27.76±5.07)，兩組家兔腦CT值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.863)。見(jiàn)表2。

2.3.2 術(shù)后12 h 顱腦NCCT，建模組家兔術(shù)后12 h CT平掃可發(fā)現(xiàn)以下3個(gè)征象：(1)腦動(dòng)脈高密度征；(2)局部腦腫脹；(3)腦實(shí)質(zhì)密度降低。同時(shí)本組4例CT圖有低密度改變或灰白界限不清,輕度腦溝展平等表現(xiàn)。建模組患側(cè)腦CT值明顯下降提示腦缺血，而偽手術(shù)組從CT值觀察亦略有上升，見(jiàn)表2，考慮由于手術(shù)等所致腦供血不足或輕度腦水腫所致。建模手術(shù)前與建模手術(shù)后12 h,CT結(jié)果顯示，家兔建模組球腦密度下降，對(duì)比偽手術(shù)組時(shí)間，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)；分組與時(shí)間的交互作用差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。分組處理間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02)。

表2 術(shù)前及術(shù)后12 h測(cè)量家兔腦組織CT值

3 討 論

在目前各類(lèi)腦血栓模型的眾多建模方法中，血栓栓塞法是其中公認(rèn)最適合溶栓治療研究需要的。大鼠是目前國(guó)際上制作各種腦梗死模型中最常用的動(dòng)物[1]。但大鼠是無(wú)腦回動(dòng)物，其腦組織和血管解剖以及腦白質(zhì)和灰質(zhì)的比例等與人類(lèi)差別較大；鼠的腦體積較小，對(duì)建立模型的技術(shù)及評(píng)價(jià)的設(shè)備條件要求高。另外，很多臨床中應(yīng)用的診斷和治療方法也難以在鼠模型上驗(yàn)證。因此腦組織較大靈長(zhǎng)類(lèi)、豬、犬等動(dòng)物模型也越來(lái)越多地被應(yīng)用到腦梗死實(shí)驗(yàn)研究中。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物無(wú)疑是研究人類(lèi)腦血管疾病的最佳選擇，但倫理學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)上的問(wèn)題都限制了該類(lèi)動(dòng)物的廣泛應(yīng)用[2]。國(guó)內(nèi)有學(xué)者報(bào)道用幼豬、犬等制作腦血管模型并用于溶栓研究。但豬ICA入顱前在顱底破裂孔近端形成由小血管組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與人類(lèi)解剖結(jié)構(gòu)差異較大[3]。故本次實(shí)驗(yàn)中采用家兔作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，家兔性格溫順，有相對(duì)較大的靶器官，其腦體積和血管直徑變異較小，在一定范圍內(nèi)與體質(zhì)量沒(méi)有相關(guān)性，穩(wěn)定性較好；能采用在人體普遍適用的方法及設(shè)備進(jìn)行檢查評(píng)估。

過(guò)去血栓模型主要采用2種類(lèi)型的血栓，即懸浮血栓(微血栓)和經(jīng)過(guò)精細(xì)切割的血栓。由于選用懸浮血栓(微血栓)容易誘發(fā)DIC且栓塞部位不穩(wěn)定，而精細(xì)切割血栓對(duì)實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備要求較高[4]。故本次實(shí)驗(yàn)中將血栓子改良為線狀血栓，0.2 mm×10.0 mm，容易制作，且比較容易控制栓塞部位。

過(guò)去對(duì)腦血栓動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要選擇病理學(xué)指標(biāo)及行為學(xué)評(píng)分，具有明顯的局限性[5-6]。本實(shí)驗(yàn)引入CT平掃及CTA技術(shù)進(jìn)行模型的評(píng)價(jià)，雖然CT平掃不能準(zhǔn)確判斷半暗帶和缺血核區(qū)，但對(duì)12 h后的腦缺血性疾病CT平掃結(jié)果提示患側(cè)密度下降，腦組織腫脹。本實(shí)驗(yàn)中家兔大腦梗死灶均由CTA及CT平掃證實(shí)，行為學(xué)評(píng)分也比較穩(wěn)定，表明此模型穩(wěn)定、重復(fù)性好。

筆者認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)中建立的腦血栓家兔模型，主要存在2個(gè)問(wèn)題。第一，采用烏拉坦做靜脈全麻，時(shí)間較長(zhǎng)且對(duì)腦組織的血氧流量等有明顯影響[7-8]。如果采用短效麻醉藥復(fù)合試劑靜脈滴注，如芬太尼和瑞芬太尼復(fù)合靜脈麻醉等，可以減少麻醉的干擾。第二，普通CT平掃檢測(cè)，難以進(jìn)行12 h內(nèi)的早期診斷。而CT灌注成像能夠在腦血栓早期的6 h內(nèi)進(jìn)行有效的準(zhǔn)確判斷[9-10]。故如果需要對(duì)腦血栓早期(12 h內(nèi))進(jìn)行建模研究，在選擇觀察評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)應(yīng)該采用CT灌注代替NCCT。

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Experiment research of improved thromboembolism method for establishing rabbit cerebral thrombosis model*

YAOXue-zhou1,LIGuo-hui2,YANGYan2,XURen3

(1.FunctionalLaboratory,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650500,China;2.DepartmentofRadiology,FirstAffiliatedHospital,YunnanCollegeofTraditionalChineseMedicine,Kunming,Yunnan650021,China;3.Library,YunnanArtUniversity,Kunming,Yunnan650500,China)

Objective To establish the rabbit cerebral thrombosis model by the improved thromboembolism method,and to introduce the CT technology for observing and evaluating this model.Methods 12 rabbits were randomly divided into the sham operation group and the model group.The catheter was retrogradely inserted from the external carotid artery to internal carotid artery.The sham operation group was injected by normal saline;the model group was injected by linear long thrombosis with the help of guiding wire.The CTA contrastive examinations was performed before and after operation;the scores of behavior disorder were observed at various time points after operation and the cranial NCCT measurements were contrasted.Results In the comparison between before and after operation in the model group,CTA at postoperative 4 h displayed that 6 cases were succeeded in placing the thrombosis from the middle section of internal carotid artery to middle cerebral artery;the behavior score and craniocerebral NCCT examination were performed after operation,the differences between the two groups were statistically significant(P<0.05).Conclusion The model is simple,easy to operate,has the stable thrombosis location,the thrombus constituents are similar to clinic,the animal injury is relatively small,the repeatability is good,which is an ideal cerebral thrombosis model of medical experimental animal.

cerebral thrombosis model; thromboembolism method; experimental animal model

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2012Y065)。

堯雪洲，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事機(jī)能實(shí)驗(yàn)科學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)研究。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.009

A

1672-9455(2015)17-2505-03

2015-03-25

2015-04-15)