總蛋白改良參考方法的建立及其用于臨床檢測結(jié)果的溯源性研究*

曾瑞麗，羅燕玲，林海標，韓麗喬，張喬軒，黃憲章，王建兵

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗科，廣州 510120)

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·論 著·

總蛋白改良參考方法的建立及其用于臨床檢測結(jié)果的溯源性研究*

曾瑞麗，羅燕玲，林海標，韓麗喬，張喬軒，黃憲章，王建兵△

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院檢驗科，廣州 510120)

目的 建立測量總蛋白(TP)參考方法，評價不同實驗室TP測定結(jié)果的溯源性。方法 參照美國疾病控制與預(yù)防中心推薦的參考方法及相關(guān)文件，建立37 ℃溫浴10 min的總蛋白參考方法。根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會系列文件對方法的精密度、正確度、線性范圍等性能進行評價。應(yīng)用該參考方法對新鮮血清進行賦值作為校準品校準廣州21家實驗室，比較校準前、后賦值血清校準品、血清樣本測定結(jié)果間的偏移，進行檢驗結(jié)果的可比性評價。結(jié)果 改良參考方法的精密度評價樣本濃度為55.48、88.68 g/L的CV分別為0.56%、1.23%，標準參考物質(zhì)909C與靶值的偏移為1.76%，分析測量范圍上限128.69 g/L。與參考方法測量結(jié)果比較，賦值血清校準品校準前平均偏移為6.38%，校準后降為1.86%，樣本血清1、2校準前偏移分別為6.04%和8.71%，校準后降為-1.61%、-0.13%。結(jié)論 改良的雙縮脲法測量TP方法性能好，應(yīng)用參考方法對新鮮血清進行賦值能夠?qū)崿F(xiàn)不同檢測系統(tǒng)結(jié)果的溯源性。

總蛋白； 溫度； 校準； 參考方法

總蛋白(TP)是觀察肝臟疾病、人體營養(yǎng)狀況等常用的檢測項目，臨床上采用37 ℃條件下雙縮脲法測量，而美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)推薦的TP參考方法為25 ℃溫浴60 min進行測量[1-2]。25 ℃實際操作中溫度不好控制，考慮到臨床結(jié)果的準確性及不同實驗室間檢測的一致性，與臨床檢測37 ℃條件相一致，本實驗室參照美國CDC推薦的參考方法，建立雙縮脲法37 ℃溫浴10 min的TP參考方法，并根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)系列文件對方法的精密度、正確度、線性范圍等性能進行評價[2]。同時采用改良參考方法對新鮮血清定植，了解定植血清校準廣州21家實驗室校準前、后結(jié)果與靶值的偏移情況，以實現(xiàn)不同實驗室TP結(jié)果的溯源性。

1 材料與方法

1.1 儀器 日立HITACHI U-3310紫外可見分光光度計(帶半導(dǎo)體溫控和磁力攪拌)；HAMILTON ML530B稀釋配液儀；美國Fluke點式溫度計(精度為0.001 ℃)；Eppendorf Research型移液器；JULABOED-19型恒溫水浴箱；Sartorius CP225D 1/100 000電子分析天平；Sartorius DOCU-PH計(精度為0.001)；IKA RH-KT/C加熱磁力攪拌器；Millipore Simplicity UA型超純水機；所有高精密度儀器均經(jīng)廣州市計量監(jiān)督局進行檢定。

1.2 試劑 氫氧化鈉(NaOH)來自Sigma公司，酒石酸鉀鈉(C4O6H4KNa)、碘化鉀(KI)、五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)來自阿匹斯公司提供，試驗用水為法國Millipore生產(chǎn)的超純水(電導(dǎo)率小于2 s/cm、pH值為6～7)，按照IFCC頒布的SOP進行配制。

1.3 標本 (1)2013國際參考實驗室比對標本(RELA-A、RELA-B)用于評價方法的精密度和正確度，同時有證參考物質(zhì)909C用于正確度評價；(2)線性評價試驗的標本采用高值新鮮血清，無肉眼可見的溶血、黃疸、乳糜；(3)制備TP校準品：為1個濃度的新鮮血清，混勻，用參考方法定植，分裝保存于-70 ℃以下冰箱，各參加實驗室現(xiàn)場取樣；(4)用于比對的樣本：為2個濃度的新鮮血清，保存于-70 ℃。

1.4 參考方法的改良 除去溫浴時間的改變，其他均參考美國CDC操作。確認水浴溫度穩(wěn)定在(37±1)℃，按測量程序37 ℃孵育10 min，測量樣本間隔時間均為3 min，儀器溫度也控制為37 ℃進行標本測量。使用2013RELA樣本，設(shè)置20 min內(nèi)對樣本連續(xù)測量，觀察反應(yīng)時間與吸光度之間的變化。

1.6 方法比較 用改良參考方法和美國CDC推薦的參考方法分別對以下物質(zhì)進行檢測，并用統(tǒng)計方法處理數(shù)據(jù)，比較其差異性：2013RELA-A和RELA-B；有證參考物質(zhì)909C；用于驗證線性的新鮮血清標本。

1.7 校準前、后比對試驗 (1)21家實驗室進行結(jié)果比對，各實驗室應(yīng)對參加本次生化分析儀進行日常維護并保證質(zhì)控在控。新鮮冰凍患者樣本，使用時請先將其置于室溫30 min(若樣本在傳遞過程中已溶化可免去此步驟)，溶化后輕輕顛倒混勻10次，4 h內(nèi)測量，測量過程中注意避免樣本蒸發(fā)(測量時才打開樣本蓋)。按本實驗室SOP程序測量樣本，2個濃度樣本均連續(xù)測量3次，取均值[6]。(2)用本實驗室所標示的靶值代替實驗室校準品的靶值，校準儀器，注意儀器其他測量參數(shù)不變。(3)校準后再測量校準品和2個濃度樣本，每個樣本連續(xù)測定3次，取均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件和Microsoft Excel2003軟件進行統(tǒng)計分析。精密度和正確度計算均值、標準差、相對偏移和變異系數(shù)等，線性采用多項式回歸分析，方法比較采用t檢驗分析。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)完成所需時間 在連續(xù)測量中可以看出，樣本反應(yīng)時間到達10 min后，其吸光度值基本穩(wěn)定，得出在37 ℃孵育10 min樣本反應(yīng)可行。

2.2 精密度評價 2013年國際比對物質(zhì)RELA-A和RELA-BCV分別為0.56%和1.23%，不精密度均小于設(shè)定目標(<1.5%)。見表1。

表1 TP精密度評價

2.3 正確度評價 測量有證參考物質(zhì)909C均值與靶值的偏移為1.76%，17家實驗室中有一家實驗室結(jié)果缺失，即16家實驗室2013RELA-A、RELA-B均值分別為55.48、80.68 g/L，與用改良參考方法檢測出均值的偏移各為0.29%、1.22%，均小于允許目標(±2.5%)。見表2。

表2 TP正確度評價

2.4 線性評價 用本實驗室建立的TP改良參考方法檢測10個系列濃度的標本其檢測結(jié)果可用于線性評價。對上述試驗數(shù)據(jù)進行多項式回歸分析處理，得到TP 1、2、3次多項式模型。見表3、4。

表3 TP參考方法檢測10個系列濃度結(jié)果

2.5 方法結(jié)果比較 三組數(shù)據(jù)的方差齊性Levene結(jié)果可看出方差都相等，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

2.6 各實驗室校準前、后偏移的比較 各實驗室結(jié)果去除2個離群值，校準前檢測賦值血清校準品組的最大偏移為 17.99%，平均偏移為6.38%；使用改良參考方法定植的蛋白校準品后，最大偏移降為4.64%，平均偏移降為1.86%，樣本血清1樣本血清2校準前結(jié)果為6.04%和8.71%，校準后為-1.61%和-0.13%。見表6。

表4 TP多項式回歸分析結(jié)果

注：-表示無數(shù)據(jù)。

表5 方法比較統(tǒng)計處理結(jié)果

表6 校準前后結(jié)果比較(%)

3 討 論

TP是臨床常用的生化檢查項目，包括清蛋白和球蛋白，其測定對了解機體營養(yǎng)狀況，以及肝臟和腎臟病變的診斷、治療判斷與監(jiān)測等發(fā)揮重要作用[7]。早在1974年，美國臨床化學(xué)協(xié)會開展了就血清TP的內(nèi)部試驗研究，即用雙縮脲法建立測量TP的標準[2]。這就為作者引出了參考方法的概念，參考方法要求測量方法干擾因素少、系統(tǒng)誤差很小，又有合適的精密度、特異度和較寬的分析范圍。CDC推薦了在25 ℃溫浴60 min的TP參考方法，在實現(xiàn)方法的溯源和臨床試驗間結(jié)果的比對已廣泛被應(yīng)用和認可[1-2]。

在臨床實際檢測中，國內(nèi)實驗室采用37 ℃溫浴條件下雙縮脲法測定血清TP，鑒于此，本實驗室參考CDC基本操作，建立(37±1)℃溫浴10 min測量TP，其方法性能的評價如精密度、正確度、線性等都達到要求范圍內(nèi)。為了考察吸光度與反應(yīng)時間的關(guān)系，本實驗室以10 min為界點，評估了10 min前的一組吸光度數(shù)值(1、2、3、4、5、6、7、8、9 min)和10 min后在10～13 min內(nèi)每隔10 s的吸光度值，與10 min這一點值計算偏移，10 min前的偏移范圍為0.23%～8.50%，10 min后偏移范圍為0.05%～0.44%，選擇溫浴10 min比較合適，雖然在溫浴10 min后的一段時間吸光度仍有所變化，但只要時間控制好，則可保證結(jié)果的穩(wěn)定。

對21家實驗室校準前后測量結(jié)果，與改良參考方法賦值的靶值的偏移結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，賦值血清校準品校準前平均偏移為6.38%，校準后降為1.86%，樣本血清1、2校準前偏移分別為6.04%和8.71%，校準后降為-1.61%、-0.13%，結(jié)果表明，通過使用新鮮血清賦值校準不同實驗室測量，各實驗室結(jié)果的準確性和一致性都有極大的提高。由此可見，應(yīng)用參考方法定植新鮮血清作為校準品進行校準，是實現(xiàn)實驗室間量值溯源的有效途徑，保證了結(jié)果的可比性。在試驗過程中，使用了Sigma試劑和北京阿匹斯公司試劑在相同條件下對同一物質(zhì)進行測量，發(fā)現(xiàn)試劑的不同其結(jié)果有一定偏移。當(dāng)然，在后續(xù)工作中，為更好地實現(xiàn)實驗室間、甚至地區(qū)間的結(jié)果比對，更多更廣的實驗室、試劑廠家應(yīng)納入進來。

[1]Doumas BT,Bayse DD,Carter RJ,et al.A candidate reference method for determination of total protein in serum.Ⅰ.development and validation[J].Clin Chem,1981,27(10):1651-1654.

[2]Doumas BT,Bayse DD,Carter RJ,et al.A candidate reference method for determination of total protein in serum.Ⅱ.test for transferability[J].Clin Chem,1981,27(10):1642-1650.

[3]National Committee for Clinical Laboratory Standards.User verification of performance for precision and trueness:approved guideline-second edition[S].EP15-A2,NCCLS,2008.

[4]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Evaluation of linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach;approved guideline[S].EP6-A,NCCLS,2003.

[5]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Evaluation of the linearity of quantitative measurement procedures:a statistical approach,approved guideline[S].EP6-A,2003.

[6]譚柏松,劉光明,張偉堅,等.兩種不同檢測系統(tǒng)測定血清總蛋白的可比性分析[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2013,10(6):689-693.

[7]王時南,楊歡.兩種校準品和3種雙縮脲試劑測定血清總蛋白結(jié)果偏移評估及方法學(xué)評價[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2011,40(10):125-128.

Research on establishment of improved reference method for detecting total protein and traceability for its use in clinical detection results*

ZENGRui-li,LUOYan-ling,LINHai-biao,HANLi-qiao,ZHANGQiao-xuan,HUANGXian-zhang,WANGJian-bing△

(DepartmentofClinicalLaboratory,SecondClinicalCollege,GuanzhouUniversityofChineseMedicne,Guangzhou,Guangdong510120,China)

Objective To establish a reference method for detecting the serum total protein (TP) and to evaluate the traceability of the TP detection results by different laboratories.Methods The improved reference method of 10 min warm bath at 37 ℃ for detecting TP was established in accordance with the reference method recommended by the US Centers for Disease Control and Prevention and the related documents.The performance of accuracy,precision,linear range was evaluated according to the American Association of Clinical Laboratory Standardization.This reference method was used to conduct the value assignment on fresh as serum calibrator for adjusting 21 laboratories in Guangzhou.The bias of detection results in the assignment serum calibrators and serum samples were compared between before and after calibration.The feasibility evaluation of detection results was performed.Results In the precision evaluation by the improved reference method,the coefficients of variation(CV) for two different concentrations of 55.48 and 88.68 g/L were 0.56% and 1.23% respectively,the shift of standard reference substance 909C and the target value was 1.76%,the upper limit of analytical detection range was 128.69 g/L.Compared with the detection results by the reference method,the average shift of the assignment serum calibrator before calibration was 6.38%,which after calibration was decreased to 1.86%,the shifts of sample serum 1 and 2 before calibration were 6.04% and 8.71% respectively,which after calibration were decreased to -1.61% and -0.13% respectively.Conclusion The improved biuret method has good performance for detecting TP.Using the reference method for conducting the value assignment on fresh serum can realize the traceability of results by different detection systems.

total protein; temperature; calibration; reference method

國家科技重大專項基金資助項目(2012ZX09303009-003)；廣東省中醫(yī)院拔尖人才基金資助項目(2011KT647)；2012年廣東省科技計劃項目(2012KT1428)。

曾瑞麗，女，在讀碩士，主要從事檢驗結(jié)果的量質(zhì)溯源工作研究?！?/p>

，E-mail:wangjianbing625@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.17.001

A

1672-9455(2015)17-2483-03

2015-03-27

2015-05-06)