靈芝孢子粉對百草枯中毒大鼠肺組織保護作用機制的研究*

趙愛華 周亞東 徐靜 史繼學 韓秋風 趙云來

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學科，山東泰安271000)

靈芝孢子粉對百草枯中毒大鼠肺組織保護作用機制的研究*

趙愛華 周亞東 徐靜 史繼學 韓秋風 趙云來

(泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診醫(yī)學科，山東泰安271000)

目的通過觀察靈芝孢子粉對百草枯中毒大鼠肺組織及血清氧化應激和炎癥因子水的影響，探索其對肺損傷的保護作用。方法將72只(SD)大鼠隨機分為正常對照組(A組)、百草枯模型組(B組)、靈芝孢子粉治療組(C組)，B組和C組再分為1 h、6 h、24 h、72 h 4個亞組，每個亞組8只。A組給予生理鹽水20 mg/kg一次性灌胃，B組和C組采用20％百草枯溶液20 mg/kg一次性灌胃，然后分別給予等容積的生理鹽水、靈芝孢子粉150 mg/ kg/q12 h灌胃。按時間點取股動脈血清測定IL-6水平，處死后取肺組織，觀察病理變化，采用ELISA法測定肺組織中TGF-β1和TNF-a含量;應用黃嘌呤氧化酶法測定血清SOD活力。結(jié)果B組、C組大鼠肺組織均出現(xiàn)大片出血、壞死，但C組大鼠肺組織損傷程度較B組顯著減輕。與A組比較，B、C組肺組織1 h、6 h、24 h、72 h TGF-β1表達顯著增加(P＜0 01)，但C組較B組為低(P＜0.05)。與A組比較，B組及C組肺組織中TNF-a、血漿IL-6從第6 h開始顯著增加(均P＜O.01)，但C組在各時點均較B組為低(均P＜O.05)。C組在各時點的SOD活力均較B組為高(均P＜0.05)。結(jié)論靈芝孢子粉能減輕百草枯對大鼠肺組織的損傷，其機制可能與抑制TGF-β1的表達、降低肺組織TNF-a含量及血清lL-6水平、提高SOD的含量有關(guān)。

靈芝孢子粉;百草枯中毒;急性肺損傷;轉(zhuǎn)化生長因子-β1;超氧化物歧化酶

百草枯是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的除草劑，對人畜毒性較大，百草枯可經(jīng)皮膚黏膜、呼吸道、消化道進入體內(nèi)，其中毒機制目前尚不清楚，因無特效解毒藥，常規(guī)治療效果差，臨床病死率高達73.2％［1］。目前臨床上主要以對癥處理及血液凈化治療為主，暫無理想的治療手段。因此尋找一種有效治療百草枯中毒的方法甚為迫切。靈芝孢子是靈芝的生殖細胞，具有抗炎、抗缺氧、抗腫瘤、抗衰老及抗肝纖維化等作用。靈芝孢子粉能激活巨噬細胞的吞噬功能，增強非特異性免疫功能，提高體液免疫水平和細胞免疫水平［2］。但至今尚未見到有關(guān)靈芝孢子粉治療百草枯中毒的相關(guān)文獻，因此本研究采用動物實驗的方法建立中毒模型，中毒大鼠肺組織TGF-β1和TNF-a的含量，血清IL-6水平、SOD的變化，探討靈芝孢子粉對百草枯中毒大鼠急性肺損傷的保護作用及機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠72只，7周齡，體重180～200g，清潔級;由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供，并在清潔級環(huán)境下采用標準顆粒飼料和標準飲用水按常規(guī)飼養(yǎng)。動物生產(chǎn)許可證號: scxK(魯)2013-0001，動物使用許可證號:SYxK (魯)2012-0005，并通過倫理審批。百草枯購于梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度＞98.0％;靈芝破壁孢子粉為山東寶來利來生物工程股份有限公司產(chǎn)品;TGF-β1、TNF-a和IL-6 ELISA試劑盒均為武漢博士德公司產(chǎn)品。SOD試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。Infinite F200多功能酶標儀為瑞士TECAN公司提供。多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)為OLYMPUS公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組和模型制備

將實驗大鼠隨機分為3組:正常對照組(A組)、百草枯模型組(B組)、靈芝孢子粉治療組(C組)，正常對照組8只;百草枯模型組32只(再分為4個亞組，分別為百草枯中毒后1、6、24、72h組，各8只);靈芝孢子粉治療組32只(再分為4個亞組，分別為靈芝孢子粉治療后1、6、24、72h組，各8只)。采用一次性灌胃百草枯溶液制備急性百草枯中毒肺損傷模型，灌胃劑量:百草枯(20％百草枯原液20 mg/kg)灌胃，C組予等容積百草枯灌胃;A組予等容積的0.9％氯化鈉溶液灌胃。C組在百草枯灌胃中毒后即刻予灌胃靈芝孢子粉150 mg/kg，每隔12 h灌胃1次。B組及A組予灌胃相同劑量的0.9％氯化鈉溶液，每隔12 h灌胃1次。

1.3 方法

1.3.1 標本采集與檢測正常對照組在1 h后予10％水合氯醛0.5 ml/100 g麻醉，股動脈取血后處死大鼠;百草枯模型組和靈芝孢子粉治療組分別在中毒后1、6、24、72 h予10％水合氯醛0.5 ml/100 g麻醉，股動脈取血后處死大鼠;3組大鼠均取右中上肺組織，將肺組織于-70℃冰箱中保存待測。

1.3.2 大鼠肺組織病理學觀察檢測結(jié)果將肺組織用4％甲醛固定，石蠟包埋，行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理學變化。

1.3.3 IL-6水平、TGF-β1和TNF-a含量、SOD活力血清中IL-6水平測定常規(guī)分離獲得血清，按試劑盒的說明書進行操作。TGF-β1和TNF-a含量測定常規(guī)取大鼠肺組織約0.5 g，加入1 ml預冷的0.9％氯化鈉溶液研磨勻漿，離心后取上清液，按試劑盒的說明書進行操作。應用黃嘌呤氧化酶法測定血清中SOD水平測定常規(guī)分離獲得血清，按試劑盒的說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 一般表現(xiàn)

大鼠百草枯中毒后1h即開始出現(xiàn)精神萎靡不振，進食、進水量減少，反應遲鈍、呼吸加快，6 h后出現(xiàn)口唇紫紺、張口呼吸，甚至呼吸窘迫等，24～72 h癥狀進行性加重，呼吸系統(tǒng)最為明顯;靈芝孢子粉治療組大鼠上述中毒表現(xiàn)有所減輕。百草枯模型組大鼠死亡16(50.00％)，靈芝孢子粉治療組大鼠死亡7只(21.87％)，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 肺組織病理改變

HE染色顯示正常對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，肺泡內(nèi)未見水腫液，肺間質(zhì)無炎性細胞浸潤(圖1A)。百草枯模型組1h出現(xiàn)明顯毛細血管擴張、充血等肺泡炎癥表現(xiàn)(圖1B)，6 h后肺泡間隔明顯增寬，肺泡腔內(nèi)充滿滲出的水腫液，部分有透明膜形成(圖1C)，24～72 h肺組織炎癥、滲出明顯，伴有出血、壞死及炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺不張、肺氣腫(圖1D、E)靈芝孢子粉治療組各時點肺組織病理改變與百草枯模型組相似，但病變程度相對較輕(圖1F)。

圖1 肺組織病理改變

2.3 各組大鼠肺組織TGF-β1的含量比較，與A組相比，隨著時間的延長，各中毒組TGF-β1含量明顯升高(P＜0.05);同時間點不同組別比較，B、C組各時間點TGF-β1含量明顯高于A組(P＜0.05)，但C組較B組明顯降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠肺組織TGF-β1含量比較

2.4 各組大鼠肺組織中TNF-a含量與正常對照組相比較，從第6h起百草枯模型組及靈芝孢子粉治療組的肺組織勻漿中TNF-a含量顯著增加，并且隨著時間的延長而不斷提高，在第72h達到最大值;靈芝孢子粉治療組中TNF-a含量增加較百草枯模型組相對較少，與百草枯模型組的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表2。

表2 組大鼠肺組織中TNF-a含量的比較

2.5 各組大鼠血清中IL-6水平的比較，從第6h起B(yǎng)組和C組大鼠血清中的IL-6水平有顯著增加，并隨著時間的延長而不斷增加;C組中IL-6水平增加相對較少，與B組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表3。

表3 組大鼠血清中中IL-6含量的比較

2.6 各組大鼠血清SOD水平的比較與正常對照組比較，從第6h起百草枯模型組和靈芝孢子粉治療組大鼠血清中的SOD水平有顯著降低，并隨著時間的延長而不斷降低，24小時降低之最低;靈芝孢子粉治療組中SOD水平降低相對較少，與百草枯模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，詳見表4。

表4 組大鼠血清中SOD含量的比較(pg/ml)

3 討論

關(guān)于PQ引起的急性肺損傷和肺纖維化的病理生理機制還未闡明，其中氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡均參與了PQ的病理損害過程［3-4］，其中對于肺損傷最主要機制是氧化-還原反應，百草枯通過肺泡上皮細胞和氣管Clara細胞以主動轉(zhuǎn)運的方式進行攝取進入肺內(nèi)［5］，由還原型輔酶Ⅱ(NADPH)輔助的單電子還原為自由基，經(jīng)超氧化物歧化酶(SOD)形成過氧化氫，進一步形成毒性更高的羥自由基(OH-)，大量的氧自由基產(chǎn)生，一方面直接使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷破壞細胞膜及其細胞結(jié)構(gòu);另一方面通過刺激細胞因子和粘附分子的表達，介導炎癥和免疫反應，導致及加重組織損傷，最終導致細胞死亡。因此，抑制氧化應激和炎癥反應可能是治療PQ中毒的重要策略。

靈芝是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌赤芝和紫芝的總稱，具有扶正固本等功效，靈芝孢子是含有靈芝全部遺傳活性物質(zhì)的生殖細胞，其化學成分主要包括:蛋白質(zhì)和氨基酸類、糖肽類、維生素類、同醇類、三萜類、脂肪酸類、內(nèi)酯、無機元素和生物堿類等［6］。現(xiàn)代藥理學研究證實，靈芝孢子粉具有免疫調(diào)節(jié)，抗毒、抗腫瘤、抗氧化、抗肝纖維化、抗突變、降血脂及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的雙向調(diào)節(jié)作用［7-11］。靈芝孢子粉水提取物可抑制小鼠肌肉勻漿的自發(fā)性脂質(zhì)過氧化和Fe2+/半胱胺酸引起的脂質(zhì)過氧化，使丙二醛(MDA)生成量減少，并能抑制黃瞟呤氧化酶/黃嘌呤系統(tǒng)中超氧陰離子的生成［12］。本研究結(jié)果表明，靈芝孢子粉治療百草枯中毒大鼠后，免疫組化顯示肺組織TGF-β1上升幅度有所下降，TGF-β1基因表達量相對較小，差異有統(tǒng)計學意義，說明靈芝孢子粉能夠減輕百草枯中毒大鼠肺損傷的程度。靈芝孢子粉作用機制較為復雜，從多種途徑參與百草枯中毒肺損傷保護，而其中作用機制之一可能通過降低TGF-Jβ1的表達而發(fā)揮作用。靈芝孢子粉治療組肺組織TNF-a含量及血清IL-6水平于中毒后各時間點較百草枯模型組均有顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義，提示靈芝孢子粉能減輕百草枯中毒大鼠肺臟的炎癥損傷，可為臨床治療提供依據(jù)。另外，靈芝孢子粉治療組SOD較模型組明顯升高，說明靈芝孢子粉能減輕百草枯中毒大鼠肺臟的過氧化反應，從而減輕百草枯中毒大鼠的肺纖維化程度。

百草枯中毒治療為臨床治療難題，而本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1、TNF-a、IL-6、SOD參與了百草枯中毒后肺損傷的病理生理過程，靈芝孢子粉能夠有效抑制TGF-β1的表達，降低肺組織中TNF-a含量及血清IL-6水平，增加SOD水平，起到抑制氧化應激和炎癥反應的作用，從而減輕百草枯中毒后大鼠肺組織的損傷程度，延緩肺纖維化的進程，本實驗初步闡明了靈芝孢子粉治療百草枯中毒肺損傷的可能機制，為臨床治療百草枯中毒提供了理論基礎。但靈芝孢子粉藥理作用非常復雜，臨床用量缺乏科學的統(tǒng)一標準，有待于進一步研究。

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Protect effect of lingzhi spore on paraquat poisoned rat lung tissue and its mechanism

ZHAO Ai-hua ZHOU Ya-dong XU Jing SHI Ji-xue HAN Qiu-feng ZHAO Yun-lai
(Dept.of Emergency，Affiliated Hospital of Taishan Medical Universit，Taian 271000，China)

Objective:To investigate the effect of lingzhi spore on paraquat poisoned rats lung tissue and its mechanism .Methods:Seventy-two Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into normal control group(n=8)，paraquat model group(n=32)and lingzhi spore treatment group(n=32)Rats in model and treatment groups were administered with a single dose of PQ(20 mg/kg)by gavage，then 150 mg/kg lingzhi spore(treatment group)or 0.9％saline(model group) was administered by gavage.The rats in model and treatment groups were sacrificed at 1，6，24 and 72h，after treatment，the blood samples were taken from femore arterial and the lung tissue samples were also collected.The serum IL-6 levels were measured.and the pathological changes in lung tissue were examined:the expression of TGF-β1、TNF-a were detected by enzyme linked immune-osorbent assay，the SOD levels in lung tissue were also measured by xanthine oxidase method.Results:Severe hemorrhage and necrosis were noticed pathologically in lung tissue of mode group，the degree of lung injury in treated group was attenuated compared with model group.The expression on TGF-β1 in lung tissue of both model and treatment groups at1，6，24，72h increased significantly than the control group，but the expression in treatment group was lower than that in model group(P＜0.05)The TNF-a levels and IL-6 levels of model and treatment groups began to increase from 6h after poisoninq，but those in treatment group were lower at each time points(P＜0.05).SOD significantly decreased，but SOD in every point of treatment group were upon maturity of lingzhi spore only for high in the paraquat model group(P＜0.05).Conclusion:lingzhi spore can attenuate the lung tissue injury induced by paraquat in rats，which is associated with down-regulation of TGF-β1，TNF-a expression in lung tissue and decreased serum IL-6 lev-els，improve the content of SOD and there by reduce paraquat injury of lung tissue of rats.

lingzhi spore;paraquat poisoning;acute lung injury;transforming growth factor-β1;SOD

R965

A

1004-7115(2015)10-1085-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2015.10.002

山東省自然科學基金(ZR2015PH044)。

趙愛華(1971—)，女，山東泰安人，副主任醫(yī)師，本科，主要從事臨床急診科工作。

2015-8-12)