鐵皮石斛組織快繁及移栽培養(yǎng)1)

翟明恬 劉紅霞 王亞妮

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (寧夏大地生態(tài)有限公司)

鐵皮石斛組織快繁及移栽培養(yǎng)1)

翟明恬 劉紅霞 王亞妮

(北京林業(yè)大學，北京，100083) (寧夏大地生態(tài)有限公司)

為了篩選出鐵皮石斛的最佳組織培養(yǎng)培養(yǎng)基、最佳移栽基質(zhì)、最適菌劑種類和施用方式，選取具有1～2片葉片的鐵皮石斛分化苗在3種常用組培培養(yǎng)基上培養(yǎng)，11周后，統(tǒng)計平均株高、莖粗、根長、鮮質(zhì)量的增長量、平均產(chǎn)生新根數(shù)、新孽數(shù)；選取相同長勢的鐵皮石斛組培苗，在2種常用蘭科植物培養(yǎng)基質(zhì)上移栽，將3株優(yōu)良蘭科菌根真菌制成4 g·L-1的單一液體菌劑，對鐵皮石斛移栽苗分別進行蘸根、灌根，90 d后，統(tǒng)計成活率、平均鮮質(zhì)量、株高、莖粗增長量、平均新根數(shù)。結(jié)果顯示：MS+0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液+2.4 g·L-1植物凝膠+30 g·L-1蔗糖培養(yǎng)基上生長的鐵皮石斛苗平均株高增長量、平均鮮質(zhì)量增長量、平均新根數(shù)、平均分蘗數(shù)極顯著大于其他兩組處理；移栽于V(珍珠巖)∶V(仙土)∶V(松樹皮)∶V(活苔蘚)=1∶1∶1∶2基質(zhì)上的鐵皮石斛幼苗除平均新芽數(shù)略低于移栽于V(花生殼)∶V(石灰?guī)r)∶V(蛭石)∶V(活苔蘚)=1∶1∶1∶2基質(zhì)上的鐵皮石斛幼苗外，其他生長指標均高于后者，其中新根數(shù)顯著高于后者；施用Dh57菌劑的鐵皮石斛幼苗在成活率、平均新根數(shù)、生長量方面顯著高于施用Do60、Ph03菌劑的鐵皮石斛幼苗，在株高、莖粗增長量方面極顯著高于另外4組處理；施用Ph03菌劑的鐵皮石斛幼苗平均新芽數(shù)極顯著高于施用Dh57、Do60菌劑的處理組；同一菌劑蘸根處理的幼苗生長指標均高于灌根處理。

鐵皮石斛；組織培養(yǎng)基質(zhì)；移栽基質(zhì)；菌劑開發(fā)

To sift the optimal tissue culture medium, transplantation medium, fungal inoculants and their application method ofDendrobiumofficinale, we chose the seedlings with one or two leaves to transplanted on three commonly used culture medium, and after 11 weeks, we took the statistic of the data of the average increase of plant height, stem diameter, fresh weight, root length, new root number, and new tiller number. The seedlings with the same quality after cultured were selected to be transplanted to two commonly used matrixes, fertilized by three excellent growth-promoting orchids mycorrhizal fungi strains with concentration of 4 g·L-1by dipping the root into hyphae suspensions or irrigation with hyphae suspensions. After 90 d, we calculated the data of survival rate, average fresh weight growth, plant height growth, stem diameter growth, new tiller number. Seedings grew on MS+0.34 g·L-1-KNO3+100 g·L-1potato extract +2.4 g·L-1plant gel+30 g·L-1sucrose medium with higher quality in average increase of plant height, fresh weight growth, new root number, new tiller number, showed a significant difference with the other two. Seedlings transplanted on 1 cm perlite+1 cm soil (a generally used matrix for orchids)+2 cm live moss were superior to those transplanted on peanut (1/3)+shell limestone (1/3)+vermiculite with 0.1 cm diameter(1/3) considering all indexes but the amount of new budlets. Seedlings applying Dh57 inoculants preceded these applying Do60 or Ph03 in survival rate, amount of new root number, average increase of plant height, stem diameter, however, were inferior to these applying Ph03 considering amount of new budlets. Seedlings had an obviously higher quality with the inoculants application mode of dipping rather than irrigation.

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是中國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有除弊，下氣，補五臟虛弱羸瘦，強陰，清熱，厚腸胃，輕身延年等優(yōu)良品質(zhì)[1]，在我國熱帶和亞熱帶均有廣泛分布[2]。然而，由于人為的大肆采挖和原生境的破壞，野生鐵皮石斛已經(jīng)瀕臨滅絕。供需關(guān)系的嚴重不平衡，推動了鐵皮石斛人工栽培及其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。目前，鐵皮石斛工廠化生產(chǎn)采用先組織培養(yǎng)成苗，再移栽大棚的方式。

鐵皮石斛成苗至少4個月，300多天才能出瓶，需要多次繼代培養(yǎng)，這造成污染率的增加，因而生產(chǎn)成本居高不下，對開展大面積人工栽培非常不利[2]。眾多學者在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上添加各種組分，以期縮短培養(yǎng)時間，降低生產(chǎn)成本。研究發(fā)現(xiàn)，NAA，BA等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在鐵皮石斛組織培養(yǎng)中起到生根壯苗的作用[3]，馬鈴薯汁等天然添加物也可以促進鐵皮石斛生根和壯苗[4]。

鐵皮石斛移栽時基質(zhì)的透氣性與保水性是移栽成活率高的關(guān)鍵，后期生長量是規(guī)模化生產(chǎn)成功與否的關(guān)鍵[5]。另外，由于石斛屬植物根部沒有根毛、只與菌根真菌共生、依靠菌根提供營養(yǎng)，進行大規(guī)模組培苗人工移栽時，往往因缺少適宜的共生菌根真菌的參與，導致移栽苗成活率低且生長緩慢，這種狀況大大限制了石斛產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；l(fā)展[6]，施加菌劑是一個有效的解決方法。

本研究用植物凝膠代替瓊脂，進一步比較植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和天然添加物對鐵皮石斛組培苗生根壯苗作用的優(yōu)劣；采用三因素完全隨機區(qū)組的試驗布置移栽鐵皮石斛組培苗，探究2種常用蘭科植物移栽基質(zhì)、3種蘭科植物菌根真菌制作而成的菌劑及其施用方式對鐵皮石斛移栽苗各項生長指標的影響。

1 材料與方法

植株：選擇生長一致的鐵皮石斛原球莖分化苗。

菌株：實驗室分離自野生石斛和兜蘭的共生菌根真菌，編號為Do60、Dh57、Ph03(表1)。

表1 供試菌株

試驗用品：PDA培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、蔗糖、植物凝膠、NAA、IBA、土豆提取液、KNO3、維生素B；珍珠巖、仙土、松樹皮、活苔蘚、花生殼、石灰?guī)r、蛭石；深6 cm、寬28 cm、長54 cm的穴盤；酒精；攪拌機。

鐵皮石斛生根壯苗培養(yǎng)基篩選：采用以下3種生根壯苗培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基滅菌前pH值為5.8，裝于容量為700 mL的組培瓶中，每瓶定量100 mL。

編號1：MS+2.4 g·L-1植物凝膠+30 g·L-1蔗糖。

編號2：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA+2.4 g·L-1植物凝膠+30 g·L-1蔗糖。

編號3：MS+0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液+2.4 g·L-1植物凝膠+30 g·L-1蔗糖。

在超凈工作臺上，用滅菌鑷子將具葉1～2片、莖基粗1～2 mm的鐵皮石斛原球莖分化叢生苗分成單株后編號，測量每株的鮮質(zhì)量(g)、株高(cm)、莖粗(mm)并記錄。將其垂直移栽到生根壯苗培養(yǎng)基上，每瓶3株苗，每種處理重復20瓶，用滅菌后的保鮮膜和封口膜封口，置于(22±1)℃、光照強度1 600～2 000 lx、光照周期為16 h/8 h的組培室內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察，出現(xiàn)污染及時清理。11周后，統(tǒng)計剩余組培物每株的根數(shù)(條)、分蘗數(shù)(個)，測量其鮮質(zhì)量(g)、根長(cm)、株高(cm)、莖粗(cm)，并記錄。

用Excel 2007和SPASS 20.0進行數(shù)據(jù)處理和分析。結(jié)果用“均值±標準差”表示，顯著性差異水平P取0.01和0.05。

鐵皮石斛移栽基質(zhì)、菌劑及施用方式篩選：移栽植株，在壯苗生根后的組培苗中，選擇具根2～3條，株高3～4 cm、莖粗2～3 mm且生長一致的植株，置于組培瓶中放置在移栽室進行一周的煉苗。移栽室光照強度為1 500～2 000 lx、相對濕度70%～90%、溫度(22±2)℃、光周期16 h/8 h。

移栽基質(zhì)：在預試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)以下2種適合的基質(zhì)進行對比。

編號1：使用前按V(珍珠巖)∶V(仙土)∶V(松樹皮)=1∶1∶1混勻，覆蓋活苔蘚2 cm。

編號2：使用前按V(花生殼)∶V(石灰?guī)r)∶V(蛭石)=1∶1∶1混勻，覆蓋活苔蘚2 cm。

菌劑制作：用打孔器(直徑0.5 cm)在3種菌株的菌落邊緣打取菌塊，轉(zhuǎn)接到含燕麥50 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、KH2PO41.5 g·L-1、維生素B110 mg·L-1的液體培養(yǎng)基中(每500 mL容量瓶內(nèi)裝入400 mL液體培養(yǎng)基)，每瓶40塊，置于130 rpm的搖床上，25 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 d，用攪拌機(轉(zhuǎn)頭和攪拌杯高壓滅菌)將菌絲體和發(fā)酵液一同打碎，制成質(zhì)量濃度為4 g·L-1的單一液體菌劑。

利用以下2種方式施用菌劑。蘸根，將組培苗在菌劑中浸泡2 h后移栽。對照CK1在無菌水中浸泡相同時間后移栽；灌根，組培苗移栽后，撥開基質(zhì)在根部澆灌菌劑，每株10 mL，每30 d施加1次。相應對照CK2則澆灌等量無菌水。

移栽前將所有基質(zhì)用自來水清洗干凈，121 ℃滅菌2.5 h，苔蘚浸泡于75%酒精中20 min滅菌。穴盤置于30 cm×60 cm的托盤中，所需器皿在使用前在75%的酒精中浸泡20 min。

采用三因素完全隨機區(qū)組的試驗布置，共劃分8個區(qū)組(8次重復)，每個區(qū)組16個小區(qū)，分別安排16個處理組合，這16個處理組合如表2所示。

表2 移栽基質(zhì)、菌液種類、施用方式的處理組合

注：a1表示移栽基質(zhì)1；a2表示移栽基質(zhì)2；b1表示Do60菌液；b2表示Dh57菌液；b3表示Ph03菌液；b4表示蒸餾水；c1表示蘸根方式；c2表示灌根方式。

無菌水清洗組培苗根部，用苔蘚包裹，露出根基，定殖于穴盤中。16個處理組在穴盤中以隨機方式排列，設(shè)置8個重復(區(qū)組)。定期觀察，給托盤中和穴盤中添水，保持苔蘚濕潤。

移栽前，對每株進行編號并測量記錄其株高(cm)、莖粗(mm)、鮮質(zhì)量(g)。90 d后，統(tǒng)計記錄不同移栽基質(zhì)上苗木成活株數(shù)和每株植物的新根數(shù)(條)、新芽數(shù)(個)，測量其株高(cm)、莖粗(mm)、鮮質(zhì)量(g)。計算每種處理的成活率、平均新根數(shù)、平均新芽數(shù)、平均莖粗增長量、平均株高增長量和平均鮮質(zhì)量增長量。其中，株高以植株根基到最高新芽莖稈為準，用直尺測量；莖粗以植株莖部最粗處為準，用游標卡尺測量；平均株高=∑(單株收獲時株高-單株初始株高)/株數(shù)；平均莖粗=∑(單株收獲時莖粗-單株初始莖粗)/株數(shù)；平均鮮質(zhì)量增長量=∑(單株收獲時鮮質(zhì)量-單株初始鮮質(zhì)量)/株數(shù)。

用Excel 2007和SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。結(jié)果用“均值±標準差”表示，顯著性差異水平P取0.01和0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生根壯苗的影響

結(jié)合表3和圖1A、圖1B可以看出，經(jīng)過11周的培養(yǎng)，3號培養(yǎng)基上的鐵皮石斛平均株高、鮮質(zhì)量增長量、平均根數(shù)、分蘗數(shù)分別為3.61 cm、2.666 9 g、12.55條、6.20個，極顯著高于2號和1號；平均莖粗、根長增長量分別為4.061 mm、2.03 cm,和2號不存在顯著差異，極顯著大于1號。2號培養(yǎng)基上的鐵皮石斛平均株高，莖粗、根長增長量，平均分蘗數(shù)分別為2.35 cm、3.619 mm、1.83 cm、4.58個，極顯著高于1號培養(yǎng)基；平均鮮質(zhì)量增長量為1.479 1 g，顯著高于1號培養(yǎng)基。鐵皮石斛最佳生根壯苗培養(yǎng)基為3號培養(yǎng)基：MS+0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液+2.4 g·L-1植物凝膠+30 g·L-1蔗糖。

表3 不同培養(yǎng)基對鐵皮石斛生根壯苗的影響

注：表中數(shù)據(jù)為組培11周后每種處理的“均值±標準差”；同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，同列不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

A.為11周后收獲的鐵皮石斛分化苗在組培瓶中的生長情況比較(從左到右依次為3號培養(yǎng)基、2號培養(yǎng)基、1號培養(yǎng)基)；B.為11周后收獲的鐵皮石斛分化苗的形態(tài)比較(從左到右依次為3號培養(yǎng)基、2號培養(yǎng)基、1號培養(yǎng)基)。

圖1 11周后收獲的鐵皮石斛分化苗生長情況及形態(tài)比較

2.2 鐵皮石斛移栽基質(zhì)、最適菌劑及施用方式篩選

從表4中可以看出，移栽90 d后，1號基質(zhì)上的鐵皮石斛幼苗除新根數(shù)為1.43根，顯著多于2號基質(zhì)外，其他各項指標和2號基質(zhì)均不存在顯著差異。兩種移栽基質(zhì)對鐵皮石斛影響差別并不大。

表4 不同基質(zhì)組合對鐵皮石斛組培苗移栽生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為移栽90 d后每種處理成活植株的“均值±標準差”；同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，同列不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

從表5和圖2中可以看出，使用菌劑處理的試驗組移栽苗各方面生長指標均高于未使用菌劑的對照組。Dh57菌劑在增加移栽苗成活率，促進移栽苗生根，提高株高、莖粗、生長量方面優(yōu)于Do60、Ph03的。Ph03菌劑在促進新芽萌發(fā)方面優(yōu)于Dh57、Do60。且同一菌劑蘸根處理生長指標均高于灌根處理。

表5 不同菌株處理對鐵皮石斛移栽生長的影響

注：表中數(shù)據(jù)為移栽接菌90 d后每種處理的“均值±標準差”；同列不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，同列不同大寫字母表示在0.01水平差異顯著。

圖2 不同菌株處理的鐵皮石斛生長情況

3 結(jié)論與討論

本研究對比了MS培養(yǎng)基添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1IBA和天然添加物0.34 g·L-1KNO3+100 g·L-1土豆提取液對鐵皮石斛生長的影響，兩種配方的培養(yǎng)基均有促進鐵皮石斛根系發(fā)育和生物量積累的效果。但相比之下，添加KNO3和土豆提取液最好，生根壯苗效果與添加植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)NAA、IBA達到極顯著差異，可廣泛用于鐵皮石斛的組培生產(chǎn)。另外，鐵皮石斛組培苗最終要用于藥用，而NAA和IBA均為植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，高質(zhì)量濃度下對人具有一定的傷害，尚不清楚其分解速度，因此，建議用KNO3和土豆提取液替代。

移栽基質(zhì)試驗的2種基質(zhì)配料中，樹皮和珍珠巖屬于通透性強基質(zhì)，仙土和花生殼屬于密閉型基質(zhì)且具有一定的保肥性、保水性，石灰?guī)r是野生鐵皮石斛附生的基質(zhì)，含有石斛生長所需的Ca元素。結(jié)果顯示，V(珍珠巖)∶V(仙土)∶V(松樹皮)∶V(活苔蘚)=1∶1∶1∶2基質(zhì)對鐵皮石斛組培苗的移栽效果在生根方面略優(yōu)于V(花生殼)∶V(石灰?guī)r)∶V(蛭石)∶V(活苔蘚)=1∶1∶1∶2，其他方面并無顯著性差別。苔蘚被認為是最好的假植基質(zhì)，有報道介紹在石斛及其他蘭科植物栽培過程中應先用苔蘚裹根[7]。本研究在移栽過程中也采取了此方法，并保證根系自然舒展，松緊度適宜，但結(jié)果證明該方法并不利于鐵皮石斛穴盤栽培。澆水后，由于根部被苔蘚包裹導致鐵皮石斛根部通透性差，長期積水，不利于根呼吸，爛根情況嚴重，導致本次試驗移栽成活率低(試驗中期發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象，將根部苔蘚去掉)。因此，建議在穴盤種植時不用苔蘚包根。

采用菌株Dh57(Sebacinavermifera)，Do60(Tulasnellacalospora)，Ph03(Tulasnellacalospora)制作的3種液體菌劑均能很好地促進鐵皮石斛組培苗的移栽生長，相比對照達到顯著或極顯著差異。其中施用Dh57菌劑的移栽苗在平均新根數(shù)、株高、莖粗、鮮質(zhì)量增長量、成活率方面均明顯優(yōu)于施用Ph03和Do60的移栽苗。之前的研究報道證實Sebacinaceae真菌能夠促進石斛屬種子萌發(fā)[8]。鐵皮石斛移栽生長顯示出良好的促生能力，進一步證實S.vermifera菌株是石斛屬植物優(yōu)良的菌根真菌。Ph03也顯示出較強的促生能力，尤其是促生新芽的能力與對照和其他菌株均達到極顯著差異，而同樣是T.calospora的Do60菌株(無細菌伴生)，結(jié)果明顯不如前者，這可能與Ph03菌株中含有細菌有關(guān)。成年蘭科植物菌根內(nèi)主要棲居著Pseudomonas和Bacillus類的細菌[9]，通過種子接種試驗發(fā)現(xiàn)，這類細菌能夠產(chǎn)生適量的生長素促進種子萌發(fā)[10]。進一步研究證明內(nèi)生細菌在與寄主植物長期的進化發(fā)展過程中，彼此形成了相互依存、相互作用的生態(tài)學關(guān)系。植物內(nèi)生細菌對改善植物生長環(huán)境、促進植物生長發(fā)育、增強植物抵抗不良外界環(huán)境和病蟲害侵襲等方面具有極為廣泛的生態(tài)學作用[11]。而本課題組在蘭科植物菌根真菌分離研究中同樣觀察到菌根真菌伴生細菌的現(xiàn)象，部分Tulasnella屬真菌始終與細菌伴生，伴生情況下的Tulasnella屬真菌生長快速；另一部分Tulasnella屬真菌不存在細菌伴生現(xiàn)象，相比之下生長非常緩慢。結(jié)合本次試驗結(jié)論可以推測出：伴生細菌在Tulasnella(Epulorhiza)屬真菌促進鐵皮石斛組培苗移栽生長過程中起到一定作用，其中的機理有待深入研究。

蘭科植物與菌根真菌的專一性一直是爭論的焦點[12]。普遍認為石斛屬植物與其菌根真菌專一性較低[13]，但不同的生長階段與哪種真菌共生卻有明顯的傾向[14]。本研究也證實了這一點，即從不同蘭科植物上分離得到的3株菌根真菌對鐵皮石斛組培苗移栽生長促進效果完全不同，從同屬霍山石斛成年植株根中分離的Dh57菌株能明顯促進鐵皮石斛的成活率、平均新根數(shù)、株高、莖粗和鮮質(zhì)量增長量，從同科兜蘭屬植物中分離的Ph03能夠明顯促生鐵皮石斛新芽萌發(fā)的能力，均與對照達到極顯著差異，而分離自鐵皮石斛的Do60促生效果卻低于兩者。鐵皮石斛同菌根真菌在科、屬、種的水平上專一性較低，但不同的菌根真菌能夠促進鐵皮石斛生長的作用不同。

研究采用了蘸根和灌根兩種接菌處理。張霞[15]認為單一液體菌株的注射、蘸根和菌塊接種3種不同方式對鐵皮石斛移栽成活的影響不存在顯著差異。而本研究從結(jié)果看，相同菌株的不同施用方式對鐵皮石斛的移栽生長存在顯著差異。分析這一現(xiàn)象的主要原因是，蘸根處理菌株能夠與鐵皮石斛根系充分接觸，附帶在根系的菌液比澆灌在基質(zhì)中的菌液更容易侵入根系中，形成菌根結(jié)構(gòu)。在實際操作中，蘸根方式也比灌根方式更方便經(jīng)濟，施用浸泡2h即可，無需刨根澆灌，無需后續(xù)追加，在生產(chǎn)實踐中具有更大的優(yōu)勢，值得推廣。

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Tissue Culture and Transplanting ofDendrobiumofficinaleKimura et Migo

Zhai Mingtian, Liu Hongxia(Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China); Wang Yani(Ningxia Earth Ecological Limited Company)//Journal of Northeast Forestry University，2015,43(1)：50-53，71.

DendrobiumofficinaleKimura et Migo; Tissue culture medium; Transplanting matrix; Inoculant development

1) 廣西科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃主席基金項目(09203-04)。

翟明恬，女，1989年4月生，北京林業(yè)大學林學院，碩士研究生。E-mail：zhaimingtian@163.com。

劉紅霞，北京林業(yè)大學林學院，副教授。E-mail：hxialiu@bjfu.edu.cn。

2014年7月11日。

S723.1

責任編輯：任 俐。