環(huán)境因素對溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影響

劉文竹， 李紅月，范學亭，周永燦，王世峰，謝珍玉

(海南大學 海洋學院，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南 ?？?570228)

環(huán)境因素對溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影響

劉文竹， 李紅月，范學亭，周永燦，王世峰，謝珍玉

(海南大學 海洋學院，海南省熱帶水生生物技術重點實驗室，海南 ?？?570228)

為了研究不同環(huán)境因子對溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)HN08155生物膜形成的影響，本研究采用改良的微孔板方法，結果顯示：在3個不同培養(yǎng)基中，于2216E培養(yǎng)基中生物膜形成的速度最快，與其他實驗組存在明顯差異；在pH4～9范圍內(nèi)，當pH值為7.0時，溶藻弧菌形成的生物膜量最高；質(zhì)量濃度為0.5%的NaCl最適宜溶藻弧菌生物膜的生成，但NaNO3不能促進生物膜的形成；低濃度CaCl2可促進生物膜形成，MgCl2不參與溶藻弧菌生物膜的生成.由此得出結論：溶藻弧菌生物膜的形成依賴于環(huán)境條件，不同環(huán)境因子對溶藻弧菌生物膜的形成有不同的影響.

溶藻弧菌；生物膜；環(huán)境因子

細菌所形成的生物膜是指浮游階段生存的細菌粘附在介質(zhì)表面，通過細菌間的不斷擴增伴隨著對外分泌大分子產(chǎn)物將細菌自身包裹成有組織的結構性細菌群落[1].大量研究表明，生物膜的形成是細菌為適應不同的環(huán)境而形成的一種生存策略，也是許多病原菌難以控制的重要原因[2].細菌通過形成生物膜以抵抗不利環(huán)境，攝取營養(yǎng)物質(zhì)，甚至躲避有毒有害物質(zhì).這種生存方式比浮游菌更容易在一些極端的環(huán)境下生存.Costerton等于1978年最早提出細菌生物膜的概念[3-4]，由于細菌生物膜在環(huán)境適應方面具有重要的意義，因而引起了人們的廣泛重視，進而掀起了研究細菌生物膜的熱潮.細菌生物膜是由蘑菇狀或者錐狀的大量細菌組成，其含水量高達97%，這些細菌組成生物膜上的“通道”，能夠運送營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物等.實際上，生物膜是有著結構復雜而分工有序的菌落，包括主體生物膜層、連接層、條件層、基質(zhì)層，其結構具有不均質(zhì)性[5].

溶藻弧菌為海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一，對我國特別是南方地區(qū)的海水養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的威脅[6-7].迄今為止，盡管國內(nèi)外學者對溶藻弧菌的致病機制開展了大量的研究，但對于溶藻弧菌的分子致病機理還缺乏深入了解.因此，對溶藻弧菌毒力基因和致病機理的深入研究尤為重要[9].細菌生物膜形成與否能夠明顯影響細菌侵染宿主的能力，它們在溶藻弧菌致病過程中很可能具有重要作用.

本文通過研究不同的環(huán)境因子對溶藻弧菌HN08155所形成生物膜的影響，確定了溶藻弧菌在形成生物膜的過程中對環(huán)境因子有較強的依懶性，為今后深入研究其成膜能力和侵染機制奠定了基礎.

1 菌種與方法

1.1菌株及培養(yǎng)條件 本實驗室提供的溶藻弧菌HN08155分離自患病凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)， -80℃保藏.菌株接種于2216E培養(yǎng)液中，30 ℃，12 h搖床培養(yǎng)，懸菌液6 000 g離心棄上清，用PBS重懸菌體沉淀，密度調(diào)至約OD600=0.5.

1.2 試驗方法

1.2.1 溶藻弧菌成膜的定量檢測[8]本實驗使用0.1%結晶紫染料對溶藻弧菌HN08155進行生物膜染色.取重懸菌液以1∶100比例轉接至5 mL新鮮2216E培養(yǎng)液.取200 μL培養(yǎng)液加入到無菌的96孔板中，每組12個平行樣，取新鮮的無菌2216E培養(yǎng)液為空白對照.放置30 ℃培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng).用250 μL PBS/孔沖洗2次，60 ℃干燥30min.加入0.1%結晶紫200 μL/孔，染色30 min，棄去染液，加入PBS 250 μL/孔清洗3次，60 ℃干燥30 min.加入200 μL/孔的95%乙醇，至于搖床將結晶紫燃料充分溶解.使用酶標儀測定OD570的值.

1.2.2 溶藻弧菌在不同時間形成生物膜能力測定 按方法1.2.1測定成膜量，每隔12 h取樣一次.

1.2.3 溶藻弧菌在不同培養(yǎng)基下形成生物膜能力測定 取重懸菌液以1∶100比例分別轉接至2216E、TSB和LB培養(yǎng)液中，靜置培養(yǎng)48 h，按照1.2.1的方法測細菌的成膜情況.

1.2.4 溶藻弧菌在不同NaCl和NaNO3質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況測定

取重懸菌液以1:100比例分別轉接至NaCl濃度為0、0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液，另取同樣重懸液以1:100比例分別轉接至NaNO3濃度為0、0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)48h，按1.2.1的方法測定細菌的成膜情況.

1.2.5 溶藻弧菌不同初始pH條件下成膜情況測定 取重懸菌液以1∶100比例分別轉接至初始pH為4、5、6、7、8和9的1%NaCl胰蛋白酵母培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)48 h，按照1.2.1的方法測細菌的成膜情況.

1.2.6 溶藻弧菌不同CaCl2和MgCl2質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況測定 取重懸菌液以1∶100比例分別轉接至CaCl2濃度為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液，另取同樣重懸液以1∶100比例分別轉接至MgCl2濃度為0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和0.1%的胰蛋白酵母培養(yǎng)液，靜置培養(yǎng)48 h，按1.2.1的方法測定細菌的成膜情況.

1.3 數(shù)據(jù)處理每組實驗均設置12個平行樣，結果以平均數(shù)±標準偏差表示，利用Excel、SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析.

2 結果與分析

2.1 溶藻弧菌在不同時間形成生物膜能力情況在溶藻弧菌形成生物膜的初期，隨著時間的延長，OD值逐漸增加，說明生物膜的量在逐步增加，當達到72 h，OD值最高，這時生物膜的量達到最大，而后隨著培養(yǎng)時間的延長，OD值逐漸降低，生物膜的量逐漸下降(表1、圖1)，各數(shù)據(jù)間存在顯著差異(p<0.05).

2.2 溶藻弧菌在不同培養(yǎng)基下成膜情況溶藻弧菌在2216E培養(yǎng)基中，OD值最高，溶藻弧菌所形成的生物膜量最大，顯著高于其他實驗組，其次是TSB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中形成的量最少(表2、圖2)，各數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05).

2.3 溶藻弧菌在不同NaCl和NaNO3質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況當在NaCl為0時，溶藻弧菌幾乎無法成膜，當NaCl為0.5%時，OD值達到最高，生物膜的量達到最大.當NaCl達到2%時，OD值與初始值相似，說明溶藻弧菌幾乎喪失成膜能力(表3、圖3)，數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05).在僅含有NaNO3的培養(yǎng)基中，隨著濃度的增加，OD值幾乎沒有差異(表4、圖4)(p>0.05).

表1 不同培養(yǎng)時間對溶藻弧菌生物膜形成的影響

表2 不同培養(yǎng)基對溶藻弧菌生物膜形成的影響

圖1 不同培養(yǎng)時間對溶藻弧菌生物膜形成的影響圖2 不同培養(yǎng)基對溶藻弧菌生物膜形成的影響

表3 NaCl對溶藻弧菌成膜影響

表4 NaNO3對溶藻弧菌成膜影響

圖3 NaCl 對溶藻弧菌成膜影響圖4 NaNO3對溶藻弧菌成膜影響

2.4 溶藻弧菌不同初始pH值條件下成膜情況當初始pH值為4、5和6時，溶藻弧菌幾乎無法形成生物膜，初始pH值為7時，OD值達到最高，溶藻弧菌生物膜形成量最大，顯著高于其他實驗組，在初始pH值為8～9時，OD值逐漸降低，生物膜量明顯減少(表5、圖5)，各數(shù)據(jù)存在顯著差異(p<0.05).

表5 初始pH值對溶藻弧菌成膜的影響

表6 CaCl2對溶藻弧菌成膜影響

圖5 初始pH 值對溶藻弧菌成膜的影響圖6 CaCl2對溶藻弧菌成膜影響

2.5 溶藻弧菌不同CaCl2和MgCl2質(zhì)量分數(shù)條件下成膜情況當在CaCl2為0時，溶藻弧菌幾乎無法成膜，在0.5%的濃度之內(nèi)，隨著CaCl2濃度的增加，OD值逐漸增高，生物膜的量逐漸增大(表6、圖6)，數(shù)據(jù)之間存在顯著差異(p<0.05).在僅含有MgCl2的培養(yǎng)基中，OD值幾乎沒有差異(p>0.05)，無法觀察細菌生物膜的存在(表7、圖7).

表7 MgCl2對溶藻弧菌成膜影響

圖7 MgCl2對溶藻弧菌成膜影響

3 討 論

Sauer等[10-11]認為生物膜形成過程是一種動態(tài)的過程，包括菌落初始粘附、發(fā)展、成熟和老化4個階段.本文通過對生物膜的在不同時間的測定結果表明,在靜止環(huán)境中，溶藻弧菌HN08155形成的生物膜具有4個時期的變化：24～36 h為初始期，36～60 h為發(fā)展期，60～72 h為成熟期，超過72 h為衰老期.

浮游性細菌粘附在介質(zhì)表面，這是生物膜形成的初始粘附階段.在這個階段中，細菌的粘附能力起到重要的作用，其中主要因子包括細菌的粘附素以及細菌的鞭毛.這個階段所形成的生物膜形成不穩(wěn)定，對細菌沒有形成保護結構，容易被破壞[12].在細菌粘附到介質(zhì)表面后，細菌會產(chǎn)生大量胞外產(chǎn)物，將菌落包裹起來.這些胞外產(chǎn)物將單個菌落聚起來，形成微菌落，隨著胞外產(chǎn)物不斷增加，微菌落之間逐漸連接，形成生物膜的框架.這個階段的生物對外的抗性明顯增加.伴隨著胞外產(chǎn)物的不斷增加，成熟的生物膜逐步形成.細菌生物膜根據(jù)所粘附的表面介質(zhì)，生長環(huán)境，營養(yǎng)成分等的不同，會構成形態(tài)不一的生物膜結構.這種結構厚薄不一，形態(tài)各異[13-14].在這個階段的生物膜達到穩(wěn)定狀態(tài)，對外界干擾的免疫力最強.在達到成熟期后，生物膜逐漸溶解，細菌脫落，形成浮游狀態(tài)從而形成新的循環(huán)過程[15].本文通過在培養(yǎng)基中測定溶藻弧菌在不同環(huán)境中所形成生物膜的差異.結果表明在含有豐富離子成分的2216E培養(yǎng)基，生物膜的量最大，在LB低離子培養(yǎng)基中，形成的生物膜最低.這說明，生物膜的形成不單單是依賴于保外多糖的量所決定的，與生存環(huán)境中離子成分和濃度也有密不可分的關系.

根據(jù)Carli等[16]的研究表明，溶藻弧菌最適生存鹽度為1%～4%，在本實驗中，溶藻弧菌最適成膜鹽度為0.5%，在高于0.5%NaCl的濃度時，成膜能力明顯降低，達到2%NaCl濃度時，生物膜幾乎無法形成.說明溶藻弧菌在適應海水環(huán)境等自然環(huán)境中均能正常生長生物膜，鹽度過高則會影響溶藻弧菌的成膜能力.另外，本文通過NaNO3培養(yǎng)基與相同濃度NaCl培養(yǎng)基所形成生物膜對比分析，結果表明，在NaNO3培養(yǎng)基中，溶藻弧菌的生物膜幾乎不能形成，NaNO3對溶藻弧菌成膜過程無法起到促進作用.NaCl能夠促進生物膜的形成，但NaNO3不能促進其形成，這說明溶藻弧菌在形成生物膜的過程中，對鈉鹽的誘導有選擇性調(diào)控[17].

溶藻弧菌最適生存pH值為6.0～9.0[18-19]，本實驗表明，溶藻弧菌在低于pH值為6.0的酸性環(huán)境下，成膜能力受到明顯抑制，幾乎不能形成.pH值達到7.0，生物膜形成的量最大，pH值8.0～9.0，生物膜能夠形成，但形成的量明顯下降.在天然的海洋環(huán)境中，pH值偏弱堿性，當細菌處于低營養(yǎng)的環(huán)境時，弱堿性有利于溶藻弧菌粘附在介質(zhì)表面形成生物膜，間接提高溶藻弧菌抵抗外界不利因素的生存能力.

根據(jù)Balebona等[20]研究表明，二價的陽離子能夠提高粘附細菌保外產(chǎn)物的產(chǎn)量，從而促進細菌生物膜的形成.林雅茵等[21]對銅綠假單胞菌(Pseudomnasaeruginosa)進行生物膜研究，結果表明Mg2+能夠促進生物膜的形成，推測金屬二價陽離子對多糖有穩(wěn)定作用，本文通過僅有CaCl2和MgCl2培養(yǎng)基中培養(yǎng)生物膜結果發(fā)現(xiàn)，在CaCl2培養(yǎng)基中，0～0.5%濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增高，溶藻弧菌成膜的量越大.這說明， Ca2+參與了溶藻弧菌成膜的調(diào)控過程，增強細菌與介質(zhì)表面負離子結合，形成穩(wěn)定的二價吸引力，從而提高生物膜粘附在介質(zhì)表面的穩(wěn)定性[22].在MgCl2培養(yǎng)基中，隨著MgCl2濃度的增大，OD值之間沒有差異，沒有細菌生物膜的形成.盡管二價鎂離子能夠增強細菌與表面的介質(zhì)，但對溶藻弧菌而言，鎂離子無法參與成膜的過程.

綜合實驗結果，致病性溶藻弧菌HN08155具有較強的成膜能力，其生物膜的形成與外界環(huán)境密不可分，pH、離子濃度等各種環(huán)境因素均能顯著影響其生物膜的形成.

[1] Hall-Stoodley, Luanne, Costerton J, William, et al. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases[J]. Nature Reviews Microbiology,2004, 2(2)：95-108.

[2] Davies F, David A. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents[J]. Nature Reviews Biofilm,2003, 2(2)：114-122.

[3] Costerton , William J, Geesey G G, et al. How bacteria stick[J]. Scientific American,1987(238)：86-95.

[4] 袁海蘭, 蘇建, 胡鯤, 等. 環(huán)境因子對水霉菌生物膜形成的影響. 微生物學通報, 2014，41(9)：1 829-1 836.

[5] Ahmad A, Wiedmann A, Faust M, et al. Biofilm formation and composition on different implant materials in vivo[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 2010,95(1)：101-109.

[6] 牟海津, 劉志鴻. 水產(chǎn)動物病原菌致病性胞外產(chǎn)物的研究進展.中國水產(chǎn)科學,2000,7(2)：93-95.

[7] 權太淑, 李薇, 楊喜玲.自腹瀉患者中分離溶藻性弧菌及其病原性的探討[J].中國公共衛(wèi)生, 1985,5：10.

[8] Schmidt U,Chmel H,Cobbs C.Vibrioalginolyticusinfections in humans [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1979,10(5):666-668.

[9] 王蓬勃, 馬悅, 劉琴, 等.溶藻弧菌鐵載體合成及外膜蛋白表達的研究[J]．微生物學通報,2006,33(2):48-53．

[10] Chen Q, Yan Q, Wang K, et al.Portal of entry forpathogenicVibrioalginolyticusinto large yellow croakerPseudosciaenacroceaand characteristic ofbacterial adhesion to mucus [J] .Biofilm, 2008,80(6)：332-335.

[11] Sauer K, Camper A K, EhrlichGarth D, et al.Pseudomonasaeruginosadisplays multiple phenotypes during development as a biofilm[J]. Journal of bacteriology,2002, 184(4)：1 140-1 154.

[12] Stoodley P, Sauer K, Davies D, et al.Biofilms ascomplex differentiated communities [J] .Annual Review of Microbiology, 2002 (56): 187-209.

[13] Sternberg C, Christensen B B, Johansen T, et al.Distribution of bacterial growth activity in flow-chamberbiofilms[J].Applied and Environmental Microbiology, 1999,65 (9): 4 108-4 117.

[14] 陳強, 鄢慶枇, 鄒文政, 等.環(huán)境因子對溶藻弧菌粘附大黃魚表皮粘液影響的研究[J]．海洋與湖沼,2007,38(4):361-366.

[15] O’Toole G A, Kolter R.Initiation of biofilm formation inPseudomonasfluorescensWCS365 proceeds[J] Molecular Microbiology,1998, 28 (3)：449-461.

[16] Burgemeister S, Decker E M, Weiger R,et al.Bactericidal effect of delmopinol on attached and planktonicStreptococcusSanguinisCells[J].EuropeanJournal of Oral Sciences, 2001,109 (6): 425-427.

[17] Carli A, Pane L, Casareto L,et al.Occurrence ofVibrioalginolyticusin Ligurian coast rock pools (Tyrrhenian Sea, Italy) and its association with the CopepodTigropusfulvus(Fisher 1860)[J].Applied and Environmental Microbiolology,1993, 59(6):1 960-1 962.

[18] Meluleni G J, Grout M, Evans D J, et al .Pseudomonasaeruginosagrowing in a biofilm in vitro are killed by opsonic antibodies to the mucoid exopolysaccharide capsule but not by antibodies produced during chronic lung infection in cystic fibrosis patients[J]. The Journal of Immunology,1995, 155(4)：2 029-2 038.

[19] Klausen M, Heydorn A, Ragas P, et al. Biofilm formation byPseudomonasaeruginosawild type, flagella and type IV pili mutants[J]. Molecular Microbiology, 2003,48(6)：1 511-1 524.

[20] Chen F R, Liu P C, Lee K K. Purification and partial characterization of a toxic serine protease produced by pathogenicVibrioalginolyticus[J].Microbios,1998,98(390)：95-111.

[21] Balebona M C, Morinigo M A, Faris A,et al.Influence of salinityand pH on the adhesion of pathogenicVibriostrainstoSparusaurata skin mucus[J].Aquaculture,1995,132(1/2):113-120.

[22] 林雅茵,余加林,盧起,等.鎂離子對黏液型銅綠假單胞菌生物膜形成過程的影響[J]．中國微生態(tài)學雜志,2009,6(21):515-518.

[23] Chen X, Stewart P S.Role of electrostatic interactions in cohesion of bacterial biofilms[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002,59(6):718-720．

Effects of Several Environmental Factors on the Biofilm Formation ofVibrioalginolyticusHN08155

Liu Wenzhu, Li Hongyue, Fan Xueting, Zhou Yongcan, Wang Shifeng, Xie Zhenyu

(College of Marine Science, Hainan University, Experimental Teaching Demonstration Center of Marine Biology, Key Laboratory of Tropical Aquatic Biotechnology of Hainan Province, Haikou 570228, China)

In order to analyze the effects of several environmental factors on the biofilm formation ofVibrioalginolyticusstrain HN08155, in the study, the modified microtiter-plate method was performed to detect the biofilm formation under the different conditions. The results indicated that in different medium (2216E, TSB and LB), the formation of biofilm was most rapid in 2216E; from pH 4 to 9, when pH value is 7, the amounts of bacterial biofilm was the highest; 0.5% NaCl was best suitable concentration for the forming of the biofilm ofV.algionlyticus, however,NaNO3cannot promote to produce of biofilm. The conclusion can be drawn that the different environmental factors had different effects on the biofilm formation ofV.alginolyticus.

Vibrioalginolyticus; bio-film; formation; environmental factor

2015-05-30

國家自然科學基金項目(No.31060360);國家科技支撐計劃項目(No.2012BAC18B04);海南省重大科技項目(No.ZDZX2013014);海南省自然科學基金項目(No.311031).

劉文竹(1988-)，女，山東青島人，海南大學海洋學字2012級碩士研究生， E-mail：243575001@qq.com

謝珍玉(1974-)，男，江西吉水人，教授， 碩士生導師，研究方向：水產(chǎn)動物健康養(yǎng)殖與病害控制，
E-mail：xiezyseuta@163.com

1004-1729(2015)04-0365-07

S 941.42

A DOl：10.15886/j.cnki.hdxbzkb.2015.0064