低鹽脅迫下條斑紫菜不同品系體細(xì)胞與殼孢子的耐受性差異

呂峰+周爽

摘要：以條斑紫菜野生品系WT為對照，對條斑紫菜選育品系NY-001的體細(xì)胞與殼孢子階段的耐低鹽特性進(jìn)行測定，結(jié)果表明：在正常鹽度（2.6%）下培養(yǎng)14 d，WT、NY-001品系條斑紫菜的體細(xì)胞苗與殼孢子萌發(fā)體的存活率與分裂率均無顯著差異；在1.5%下培養(yǎng)14 d，WT品系條斑紫菜體細(xì)胞的存活率、分裂率分別為62.8%、98.8%，而NY-001品系的存活率、分裂率則分別為77.4%、100.0%，WT品系的殼孢子存活率、分裂率分別為63.9%、96.8%，而NY-001品系的存活率、分裂率則分別為88.0%、100.0%；在0.8%鹽度條件下培養(yǎng)14 d的WT條斑紫菜品系體細(xì)胞存活率分別為38.5%、88.6%，而NY-001品系的存活率、分裂率則分別為52.3%、99.6%，WT品系的殼孢子存活率、分裂率分別為445%、71.4%，而NY-001品系的存活率、分裂率則分別為76.2%、96.7%；在0.3%鹽度條件下培養(yǎng)14 d的WT品系條斑紫菜的體細(xì)胞存活率、分裂率分別為30.2%、74.2%，而NY-001品系的存活率、分裂率則為33.3%、98.7%，WT品系的殼孢子存活率、分裂率分別為5.2%、28.8%，而NY-001品系的存活率、分裂率則分別為29.6%、85.2%。由結(jié)果分析可知：與野生品系相比，NY-001品系條斑紫菜具有較好的耐低鹽潛力，可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步選育，以選拔出適合低鹽海區(qū)養(yǎng)殖的條斑紫菜新品種，為養(yǎng)殖生產(chǎn)服務(wù)。

關(guān)鍵詞：低鹽脅迫；條斑紫菜；殼孢子；耐受性；體細(xì)胞；鹽度；存活率；分裂率

中圖分類號： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）02-0221-04

收稿日期：2014-04-23

基金項(xiàng)目：江蘇省南通市科技創(chuàng)新計劃（農(nóng)業(yè)）（編號：AL2010003）。

作者簡介：呂峰（1979—），男，江蘇南通人，博士研究生，講師，主要從事海洋經(jīng)濟(jì)動植物遺傳育種研究。E-mail：prlf2019@163.com。潮間帶是一個條件變化頻率特別高的環(huán)境，生活在潮間帶的海藻，每天都要經(jīng)受著露出、淹沒的陸、水2種環(huán)境的變化：落潮時暴露在大氣中經(jīng)受干旱失水或雨水浸洗，使鹽度迅速增加或降低；潮水上漲后又回到正常的海水中正常生活，因此能夠耐受較為廣泛的鹽度[1]。條斑紫菜（Porphyra yezoensis）是生活在潮間帶的一種廣鹽性海藻，在2.6%～3.3% 的鹽度范圍內(nèi)都能正常生長，適合在不同鹽度的海域栽培[2]；但當(dāng)栽培海域鹽度降至2.6%以下時，由于條斑紫菜野生品系經(jīng)過幾十年的重復(fù)使用而未經(jīng)選育，其表現(xiàn)較為敏感。近些年來，在紫菜海區(qū)栽培期間，經(jīng)常遭遇強(qiáng)臺風(fēng)及河流上游持續(xù)性的強(qiáng)降雨，導(dǎo)致表層海水的鹽度急劇下降，造成一定量的孢子苗脫網(wǎng)和幼苗死亡，對產(chǎn)量的影響較大[3]，加上目前條斑紫菜野生栽培種已經(jīng)無法適應(yīng)河口等低鹽度海區(qū)，亟待育種改良。此外，我國海岸的一個主要特點(diǎn)是河口眾多、淤泥質(zhì)海岸分布廣泛[2]，十分適合紫菜的栽培。因此，條斑紫菜耐低鹽優(yōu)良品系的選育既能保證大規(guī)模栽培的順利進(jìn)行，又有利于其向低鹽度入海河口區(qū)擴(kuò)展，從而緩解傳統(tǒng)栽培海區(qū)的栽培壓力；此外，對于像南通市洋口港等富營養(yǎng)化嚴(yán)重的低鹽度海灣地區(qū)的生態(tài)修復(fù)也能起到積極作用。本研究結(jié)合 60Co-γ 射線人工誘變、低鹽脅迫和細(xì)胞工程育種等方法篩選到1個條斑紫菜耐低鹽突變體NY-001，在其生活史的不同階段，葉狀體細(xì)胞和F1代殼孢子均表現(xiàn)出一定的耐低鹽性，可以作為耐低鹽品系繼續(xù)選育并應(yīng)用于生產(chǎn)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用條斑紫菜野生品系（WT）由江蘇省如東縣海區(qū)半浮動筏上自然生長的葉狀體中分離出來，并以自由絲狀體的形式保存于筆者所在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，保存條件參照相關(guān)文獻(xiàn)[4]。條斑紫菜突變體NY-001是以WT葉狀體為材料，經(jīng) 60Co-γ 射線人工誘變[5]和低鹽脅迫后篩選獲得的，其絲狀體純系分離和保存方法同WT。

1.2條斑紫菜貝殼絲狀體及葉狀體的室內(nèi)培養(yǎng)方法

1.2.1貝殼絲狀體的室內(nèi)培養(yǎng)方法取適量的自由絲狀體，加入少量滅菌海水后倒入小型打碎機(jī)中，將其打碎后均勻地灑在事先高溫滅菌的文蛤殼表面，使其植入殼內(nèi)。培養(yǎng)條件：鹽度2.6%，溫度（18±1） ℃，光照度20～30 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h，培養(yǎng)液由滅菌海水和MES培養(yǎng)基配制而成。培養(yǎng)14 d后第1次清洗貝殼，將其表面多余的自由絲狀體除去，加入新鮮培養(yǎng)液，以后每隔7 d清洗1次。培養(yǎng)數(shù)周后，待貝殼表面長滿絲狀體時，將培養(yǎng)溫度提高至 （22±1） ℃，光照度降至10～20 μmol/（m2·s），光-暗周期調(diào)整為8 h-16 h，培養(yǎng)液鹽度不變。約4周后，貝殼表面就會形成1層膨大藻絲。

1.2.2葉狀體的室內(nèi)培養(yǎng)方法取1～2個上述長滿膨大藻絲的貝殼置于500 mL燒杯中，加入約100 mL培養(yǎng)液和4～6根滅菌棉線（供殼孢子附著），在正常鹽度下（2.6%）充氣培養(yǎng)（促進(jìn)殼孢子的放散），培養(yǎng)條件為：溫度（18±1） ℃，光照度50～60 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h。每天12：00（殼孢子一般在10：00開始放散）取出棉線鏡檢，當(dāng)棉線上附有殼孢子時，將其置于500 mL充氣瓶中充氣培養(yǎng)。當(dāng)葉狀體長至約1 cm時，將它們從棉線上摘下，繼續(xù)充氣培養(yǎng)，1周換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件：溫度（18±1） ℃，光照度50～60 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h。

1.3WT和NY-001體細(xì)胞對低鹽脅迫的耐受性檢驗(yàn)

將日齡為40 d的WT和NY-001的葉狀體用海螺酶酶解分離出體細(xì)胞，方法同相關(guān)文獻(xiàn)[6]。將各品系分離得到的單個體細(xì)胞分別置于小號培養(yǎng)皿（直徑=6 cm）內(nèi)，培養(yǎng)液鹽度為4.0%，靜止72 h后，記錄每個培養(yǎng)皿內(nèi)的體細(xì)胞數(shù)（30個視野，10×），獲得單個視野的體細(xì)胞平均數(shù)，然后在盛有細(xì)胞的培養(yǎng)皿中分別換入0.3%、0.8%、1.5%、2.6%4種不同鹽度的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，并將盛有細(xì)胞的小號培養(yǎng)皿放入中號培養(yǎng)皿（直徑=9 cm）中，再將兩者一起放入已盛有一定蒸餾水的大號培養(yǎng)皿（直徑=12 cm）中，以減少因培養(yǎng)液水分蒸發(fā)而引起的鹽度增大[3]，光照度為40 μmol/（m2·s），其他培養(yǎng)條件同“1.2”節(jié)。每隔3 d換1次培養(yǎng)液，并觀察1次體細(xì)胞的存活、分裂情況。endprint

1.4WT和NY-001殼孢子對低鹽脅迫的耐受性檢驗(yàn)

將各品系剛放散的殼孢子分別倒入4個小號培養(yǎng)皿（直徑=6 cm）中，在正常鹽度（2.6%）下靜止培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中單個視野的平均殼孢子數(shù)（30個視野，10×）[7]，然后在附有殼孢子的培養(yǎng)皿中分別換入0.3%、0.8%、15%、2.6% 鹽度的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，不同鹽度的培養(yǎng)液由海水、蒸餾水、MES培養(yǎng)基配制而成[3]，然后將盛有殼孢子的小號培養(yǎng)皿放入中號培養(yǎng)皿（直徑=9 cm）中，再將兩者一起放入已盛有一定蒸餾水的大號培養(yǎng)皿（直徑=12 cm）中，以減少因培養(yǎng)液水分蒸發(fā)而引起的鹽度增大[3]，培養(yǎng)條件：溫度24 ℃，光照度50 μmol/（m2·s），光-暗周期10 h-14 h，每隔3 d換1次培養(yǎng)液，并觀察殼孢子的存活、分裂情況。

2結(jié)果與分析

2.1WT與NY-001體細(xì)胞對低鹽脅迫的耐受性比較

由表1可見，在正常鹽度（2.6%）下培養(yǎng)14 d，野生品系和耐低鹽品系NY-001的體細(xì)胞苗存活率無顯著差異，培養(yǎng)14 d的存活率分別為80.5%、81.2%。由表2可見，在正常鹽度（2.6%）下培養(yǎng)5 d，各品系分裂率均能在60%左右；培養(yǎng)11 d，分裂率已接近100%；培養(yǎng)14 d，2個品系的分裂率均可以達(dá)到100%，且無顯著性差異。由表1還可以看出，在15%鹽度條件下培養(yǎng)5 d，各品系體細(xì)胞存活率均為90%左右，且差異不顯著；而培養(yǎng)11 d后，WT體細(xì)胞存活率下降明顯，只有68.4%；培養(yǎng)14 d后，WT存活率只有62.8%，而耐低鹽品系NY-001的存活率則為77.4%，兩者相比差異顯著（P<0.05）。由表2 可見，1.5%鹽度條件下，分裂率隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸上升，到培養(yǎng)14 d，WT的分裂率為988%，耐低鹽品系NY-001的分裂率達(dá)到100.0%，但二者之間無顯著性差異。

系，培養(yǎng)14 d后存活率僅為 38.5%，而NY-001品系為523%，為WT品系的1.36倍，且差異極顯著（P<0.01）；隨著時間的增加，分裂率逐漸提高，到培養(yǎng)14 d時，NY-001品系的分裂率就已達(dá)99.6%，而WT品系只有88.6%。在0.3% 下培養(yǎng)8 d，WT體細(xì)胞的存活率明顯下降，只有476%，分裂率也僅有34.0%；隨著培養(yǎng)時間的延長，到培養(yǎng)14 d時，0.3%低鹽度組中WT品系體細(xì)胞的存活率繼續(xù)下降至30.2%，分裂率也受到一定影響，最終僅為74.2；在 0.3% 下培養(yǎng)14 d，耐低鹽品系NY-001的存活率逐漸下降至333%，與WT品系相比無極顯著差異?？傮w看出，沒有任何一個品系體細(xì)胞全部分裂，說明0.3%不利于條斑紫菜生長。

如圖1-A至圖1-D所示，WT品系條斑紫菜在1.5%下培養(yǎng)2周，體細(xì)胞萌發(fā)體生長情況最接近于正常鹽度組（2.6%）；而在0.8%組，WT體細(xì)胞萌發(fā)體部分細(xì)胞的色素體溢出（如箭頭所示），部分細(xì)胞色素體轉(zhuǎn)淡，假根處細(xì)胞開始膨大，假根發(fā)育不正常；在0.3%組，存活的體細(xì)胞苗分裂速度明顯變慢，部分細(xì)胞死亡和色素體溢出而導(dǎo)致其細(xì)胞數(shù)目極少。與此相比，由圖1-E至圖1-H可見，各鹽度組下培養(yǎng)的NY-001品系條斑紫菜的體細(xì)胞萌發(fā)體的形態(tài)和生長情況較野生品系更良好：在0.8%下培養(yǎng)2周，NY-001品系的體細(xì)胞萌發(fā)體細(xì)胞排列整齊，無色素體溢出；在0.3%下培養(yǎng)2周，NY-001 品系體細(xì)胞萌發(fā)體也無法形成正常的假根，但萌發(fā)體中死亡細(xì)胞的比例較野生型小，尚能較好地維持細(xì)胞活性。

2.2WT和NY-001殼孢子對低鹽脅迫的耐受性比較

表5至表8為WT與NY-001品系條斑紫菜在0.3%、0.8%、1.5%、2.6%下培養(yǎng)14 d的殼孢子存活率、分裂率。由表5可見，在正常鹽度（2.6%）下，隨著培養(yǎng)時間的延長，各品系條斑紫菜殼孢子的存活率逐漸下降：培養(yǎng)5 d，各品系殼孢子的存活率基本維持在90%以上，耐低鹽品系NY-001的存活率與野生型相比，無顯著差異；培養(yǎng)14 d，各品系殼孢子的存活率基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，WT品系的存活率只有804%，與NY-001有顯著性差異（P<0.05）。由表6可見，各品系殼孢子的分裂率隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸上升，培養(yǎng)14 d，2.6%鹽度處理下，2個品系殼孢子的分裂率均為100.0%，不存在顯著性差異。

如表5所示，與2.6%處理一樣，1.5%處理各品系殼孢子的存活率也隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸下降：培養(yǎng)8 d后，WT品系殼孢子的存活率只有71.0%，與NY-001品系的94.2%存在極顯著差異（P<0.01）；培養(yǎng)14 d后，WT品系殼孢子的存活率下降為63.9%，而選育品系的存活率高達(dá)880%，與NY-001品系有極顯著差異（P<0.01）。由表6可見，1.5%處理的分裂率與2.6%處理相比也略有下降：培養(yǎng)8 d后，選育品系的分裂率在90%以上，而野生品系的分裂率只有70.3%，與WT品系存在顯著差異（P<0.05）；培養(yǎng) 14 d，選育品系的分裂率達(dá)100.0%，WT品系的分裂率為968%，與WT品系無顯著差異。由表7可知，與1.5%、2.6% 組相比，0.8%鹽脅迫處理2個品系殼孢子的存活率隨著培養(yǎng)時間的延長而明顯下降：培養(yǎng)8 d后，WT品系殼孢子的存活率下降至57.3%，與NY-001品系的86.9%存在極顯著差異（P<001）；培養(yǎng)14 d，WT品系殼孢子的存活率不到50%（445%），NY-001品系殼孢子的存活率為762%，為WT品系的1.7倍，且差異極顯著（P<0.01）。由表8可見，0.8%鹽度下，2個品系殼孢子的分裂率與1.5%、2.6% 組相比也有明顯下降，培養(yǎng)14 d后，WT 、NY-001品系殼孢子的分裂率分別為714%、96.7%，可見選育品系的分裂率與野生品系相比存在極顯著差異（P<0.01）。與 2.6% 處理相比，0.3%處理各品系殼孢子的存活率隨著培養(yǎng)時間的延長而急劇下降：培養(yǎng)8 d后，WT品系殼孢子的存活率不到20%（15.3%），與NY-001品系的51.4%存在極顯著差異（P<001）；培養(yǎng)14 d，WT品系殼孢子的存活率非常低，只有52%，NY-001品系殼孢子的存活率也不高，為296%，為WT品系的5.7倍，差異極顯著（P<0.01）。如表8所示，03%鹽度下，各品系殼孢子的分裂率與 2.6% 組相比也表現(xiàn)為急劇下降，培養(yǎng)14 d后，各品系殼孢子的分裂率均未達(dá)到100%，分別為28.8%、85.2%。綜合比較可見，選育品系的分裂率與野生品系相比存在極顯著差異（P<0.01）。endprint

從圖2可以看出，培養(yǎng)2周的WT品系在2.6%鹽度處理下殼孢子萌發(fā)體顏色鮮艷，有光澤，形狀規(guī)則，細(xì)胞排列均勻，星狀色素體清晰（圖2-A）；1.5%處理的殼孢子苗假根處細(xì)胞色素體收縮、部分細(xì)胞排列不均勻（圖2-B）；0.8% 組的殼孢子苗顏色加深，光澤變差，形狀變畸形，大部分細(xì)胞變小且色素體明顯收縮、假根處細(xì)胞部分死亡（圖2-C）；0.3%組的殼孢子苗顏色更深，無光澤，無假根，基部細(xì)胞全部死亡，只剩少量稍部細(xì)胞，苗體畸形（圖2-D）。與此相比，培養(yǎng)2周后，各鹽度組NY-001品系的殼孢子萌發(fā)體生長明顯優(yōu)于WT品系，只是0.3%處理的殼孢子萌發(fā)體顏色略有加深，個別細(xì)胞色素體收縮，出現(xiàn)假根腐爛的情況（圖2-E至圖2-H）。

3結(jié)論

紫菜是一種廣鹽性海藻，在2.6%～3.3%的鹽度范圍內(nèi)都能正常生長，適合在不同鹽度的海域栽培[2]；但當(dāng)栽培海域鹽度降至2.6%以下時，由于條斑紫菜野生品系經(jīng)過幾十年的重復(fù)使用而未經(jīng)選育，其表現(xiàn)較為敏感，尤其是殼孢子的存活率、分裂率均會發(fā)生顯著的變化，這在本研究的試驗(yàn)結(jié)果中得到印證。

目前紫菜的人工大規(guī)模栽培所選用的栽培種仍為野生種，經(jīng)幾十年的反復(fù)使用，未經(jīng)選育，由于栽培過程中種質(zhì)來源單一、優(yōu)良性狀的分離以及遺傳結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致抵抗低鹽、高溫、病害等逆境的耐受性大大降低[8-9]，使得紫菜的產(chǎn)量和質(zhì)量得不到保障；因此篩選優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的新品系有利于促進(jìn)紫菜栽培業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

嚴(yán)興洪等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鹽度低于1.96%時，條斑紫菜葉狀體的營養(yǎng)細(xì)胞存活率顯著降低[10]；嚴(yán)興洪等的其他研究也發(fā)現(xiàn)，壇紫菜野生品系的體細(xì)胞在0.8%下培養(yǎng)6 d后開始吸水膨脹，細(xì)胞內(nèi)色素體以外的空隙明顯增大[3]。本研究表明，在0.8%下，NY-001品系的體細(xì)胞及殼孢子的存活率與分裂率也均顯著降低，但在同等條件下，都比WT品系耐低鹽脅迫能力增強(qiáng)；當(dāng)鹽度下降至0.3%時，雖然NY-001品系的體細(xì)胞及殼孢子的存活率、分裂率仍然明顯高于WT品系，但觀察其細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，已出現(xiàn)了部分細(xì)胞的潰敗與凋亡。

條斑紫菜的生活史分為單倍體的葉狀體階段與二倍體的絲狀體階段[7]，而體細(xì)胞屬于葉狀體階段細(xì)胞，殼孢子則屬于絲狀體發(fā)育成熟后產(chǎn)生的F1代細(xì)胞，為了驗(yàn)證中選育出的NY-001品系的耐低鹽性能否穩(wěn)定遺傳到后代中，筆者對該品系生活史的2個階段的細(xì)胞做了詳細(xì)的低鹽脅迫條件下的測試，試驗(yàn)結(jié)果初步證實(shí)，在體細(xì)胞階段和殼孢子階段，NY-001品系的耐低鹽特性都是顯著優(yōu)于WT品系的。

綜上所述，篩選得到的優(yōu)良品系NY-001的耐低鹽性是顯著優(yōu)于WT品系的，可以對其進(jìn)行進(jìn)一步選育，并逐漸把它們培育成耐低鹽的優(yōu)良品種，用于海區(qū)養(yǎng)殖生產(chǎn)，為地方特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供品種保障。

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