柴芍胃炎顆粒對(duì)胃潰瘍大鼠黏膜細(xì)胞因子的影響

李　兵，肖國(guó)輝，馮　雯，王天剛，曾　俊，向　未，楊偉興（.四川醫(yī)科大學(xué)03級(jí)研究生，四川　瀘州　646000；.四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院脾胃病科，四川　瀘州　646000）

柴芍胃炎顆粒對(duì)胃潰瘍大鼠黏膜細(xì)胞因子的影響

李兵1，肖國(guó)輝2，馮雯1，王天剛2，曾俊2，向未2，楊偉興2
（1.四川醫(yī)科大學(xué)2013級(jí)研究生，四川瀘州646000；2.四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院脾胃病科，四川瀘州646000）

［摘要］目的：研究柴芍胃炎顆粒對(duì)胃潰瘍愈合的影響，并探討其機(jī)制。方法：40只wistar大鼠，隨機(jī)分為正常組、模型組、奧美拉唑組、柴芍胃炎顆粒組（簡(jiǎn)稱胃炎顆粒組），采用改良Takagi法制作乙酸胃潰瘍大鼠模型，治療13天后測(cè)量各組潰瘍指數(shù)，用免疫組化法檢測(cè)胃黏膜細(xì)胞Bcl-2、NF-κB蛋白的陽(yáng)性密度。結(jié)果：柴芍胃炎顆粒組與其他組比較潰瘍指數(shù)明顯降低（P＜0.01），柴芍胃炎顆粒組與奧美拉唑組Bcl-2的表達(dá)明顯高于模型組（P＜0.01），且柴芍胃炎顆粒組高于奧美拉唑組（P＜0.01）。柴芍胃炎顆粒組NF-κB的表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.01）。結(jié)論：柴芍胃炎顆粒能通過(guò)提高Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡、降低NF-κB蛋白的表達(dá)促進(jìn)潰瘍愈合，并可能是其促進(jìn)潰瘍愈合機(jī)制之一。

［關(guān)鍵詞］柴芍胃炎顆粒；胃潰瘍；BCl-2；NF-κB；實(shí)驗(yàn)研究

［Abstract］Objective：To study the protective effect of Chaishao Weiyan Granules on gastric ulcer of rats and its effective mechanism. Method：40 healthy wistar rats were randomly divided into model group，Chaishao Weiyan Granules group，omeprazole treatment group and normal group. The rat model of gastric ulcer was made by Takagi’s method with some modification. After the rats were treated for 13 d，the index of each group of ulcer and the expression of Bcl-2 and NF-κB in the gastric ulcer tissues was examined by immunohistochemical method. Result：Chaishao Weiyan Granules group could obviously decrease the ulcer index more than the others group（P＜0.01）. Compared with that of the model group，the expression of Bcl-2 in Chaishao Weiyan Granules group and omeprazole group was significantly higher（P＜0.01）and that of Chaishao Weiyan Granules group was higher than that of omeprazole group（P＜0.01）.The expression of NF-κB Chaishao Weiyan Granules group was significantly lower than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：Chaishao Weiyan Granules could increase Bcl-2 to inhibit apoptosis and reduce the expression of NF-κB protein to promote ulcer healing，which may be one of the mechanisms to promote ulcer healing.

［Key Words］Chaishao Weiyan Granules；Gastric ulcer；Bcl-2；NF-κb；Experimental study

消化性潰瘍（peptic ulcer，PU）是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病，人群中患病率高達(dá)5%～10%［1］，且95%的消化性潰瘍發(fā)生在胃和十二指腸。中醫(yī)藥治療消化性潰瘍具有多靶點(diǎn)、多途徑的［2］獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本文采用免疫組化的方法，觀察柴芍胃炎顆粒治療大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的效果，及其對(duì)胃黏膜細(xì)胞Bcl-2、NF-κB表達(dá)的影響，探討其治療胃潰瘍的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物：清潔級(jí)Wistar大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（190±40）g，由四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào)為SYXK（川）2013-065。

藥物：柴芍胃炎顆粒。藥物組成為柴胡、白芍、黃連、吳茱萸、丹參、延胡索、枳殼等。采用中藥免煎顆粒，每袋10g，由四川醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑室提供（生產(chǎn)批號(hào)：川藥制字Z20080300），奧美拉唑膠囊（悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)14340346）。

儀器與試劑：熒光正置顯微鏡（日本Nikon80i），戊巴比妥鈉粉劑（武漢博士德有限公司），GTVISION TMⅠ型免疫組化檢測(cè)試劑盒（基因科技上海有限公司），NF-κB、Bcl-2免疫組織化學(xué)染色抗體試劑盒（abcam艾博抗上海貿(mào)易有限公司）。以上試劑均按照試劑盒說(shuō)明書制備和使用。

2　實(shí)驗(yàn)方法

分組及模型制備：將40只wistar大鼠隨機(jī)分為4組，分別是正常對(duì)照組、病理模型組、胃炎顆粒組、奧美拉唑組，每組各10只，除正常對(duì)照組外，余3組按照Takagi［3］方法改良造模，造模前大鼠禁食24h，不禁水，用1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定于解剖板上，腹壁劍突下剪毛，常規(guī)消毒鋪巾，從劍突下縱向剪開(kāi)腹壁約3cm，沿腹白線剪開(kāi)腹壁，打開(kāi)腹腔，可見(jiàn)腹部器官，以無(wú)齒鑷沿肝臟后找出胃，0.25mL注射器在胃竇前壁近小彎側(cè)注入0.03mL100%乙酸，達(dá)胃壁肌層與漿膜層之間（進(jìn)針約0.4～0.5mm）［4］。2mL青霉素腹腔沖洗，以縫合線將腹膜、腹壁各層組織間斷縫合，再間斷縫合皮膚。

動(dòng)物分組及喂藥：造模后第3天開(kāi)始給藥，奧美拉唑組予奧美拉唑溶液，濃度為0.4mg/mL，按1mL/100g灌胃，日1次；胃炎顆粒組給予1.25g/mL，按1mL/100g灌胃，日1次；正常對(duì)照組、模型組灌喂生理鹽水，按1mL/100g灌胃，日1次。

標(biāo)本采集及處理：灌胃13天后停藥，各組大鼠禁食24h，頸椎脫臼法處死；剪開(kāi)大鼠腹腔，分別結(jié)扎幽門、賁門端后取出胃，沿胃大彎剪開(kāi)，冰生理鹽水沖洗，以潰瘍瘢痕平行于胃長(zhǎng)軸方向的最長(zhǎng)徑為中心取材，迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24h。按照常規(guī)脫水、二甲苯透明、石蠟包埋5μm厚度，以瘢痕的最長(zhǎng)徑為中心連續(xù)切片。

檢測(cè)指標(biāo)及方法：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法，用分規(guī)測(cè)量潰瘍體積，潰瘍長(zhǎng)度為潰瘍的最大直徑，寬度為與直徑垂直的最寬距離［5］。潰瘍面積=長(zhǎng)×寬，深度按大于或小于2mm計(jì)算。潰瘍體積仿Okabe法［6］，用潰瘍指數(shù)（ulcer index，UI）表示，分10級(jí)。見(jiàn)表1。

表1　大鼠潰瘍指數(shù)計(jì)算方法

免疫組化染色法：操作方法按照試劑盒說(shuō)明書。其檢測(cè)結(jié)果判定棕黃色顆粒為細(xì)胞漿或細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)。染色后運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖像分析儀（Motic images軟件系統(tǒng)）進(jìn)行圖像半定量分析測(cè)定，每組隨機(jī)抽取5只大鼠切片各1張，每張隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行積分光密度值（integrated o ptical dens ity，IOD）測(cè)量。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s ）表示。多組均數(shù)比較采用ANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用非配對(duì)t檢查，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3組潰瘍指數(shù)測(cè)定結(jié)果比較見(jiàn)表2。

表2　3組潰瘍指數(shù)測(cè)定結(jié)果比較 （mm2，±s）

表2　3組潰瘍指數(shù)測(cè)定結(jié)果比較 （mm2，±s）

組 別　n 　　潰瘍指數(shù)模型組　10　17.31±0.59奧美拉唑組　10　8.95±0.35△胃炎顆粒組　10　6.49±0.18△*

注：與模型組比較，△P＜0.01；與奧美拉唑組比較，*P＜0.01。

形態(tài)學(xué)觀察免疫組化染色顯示，在正常對(duì)照組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞中，可見(jiàn)Bcl-2蛋白表達(dá)較強(qiáng)，主要集中在腺管內(nèi)，并且表達(dá)顆粒較粗；而在胃炎顆粒組中，Bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)主要集中在胃黏膜底部，黏膜表層較弱。各組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的陽(yáng)性密度結(jié)果比較見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠黏膜上皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的陽(yáng)性密度結(jié)果比較（%，±s）

表3　各組大鼠黏膜上皮細(xì)胞Bcl-2蛋白的陽(yáng)性密度結(jié)果比較（%，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01；與奧美拉唑組比較，*P＜0.01。

組 別　n 　　陽(yáng)性密度正常組　10　24.20±0.34模型組　10　12.17±0.56奧美拉唑組　10　14.57±0.32胃炎顆粒組　10　22.01±0.36△*

形態(tài)學(xué)觀察正常組大鼠，胃黏膜細(xì)胞胞漿中有NF-κB蛋白表達(dá)，胞核未見(jiàn)明顯表達(dá)。造模13d，模型組隨著潰瘍的愈合，再生黏膜胞漿、胞核均有表達(dá)，此時(shí)NF-κB蛋白具有失活和活化兩種狀態(tài)；而胃炎顆粒組和奧美拉唑兩組中，核染色均不及模型組，染色部位主要以胃黏膜腺上皮細(xì)胞胞漿為主。

各組大鼠胃黏膜NF-κB蛋白的陽(yáng)性密度結(jié)果比較見(jiàn)表4。

表4　各組大鼠黏膜上皮細(xì)胞NF-κB蛋白陽(yáng)性密度結(jié)果比較 （%，±s）

表4　各組大鼠黏膜上皮細(xì)胞NF-κB蛋白陽(yáng)性密度結(jié)果比較 （%，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.01。

組 別　n 　　陽(yáng)性密度正常組　10　 0.33±0.40模型組　10　 5.40±0.07奧美拉唑組　10　 2.95±0.09△胃炎顆粒組　10　 2.80±0.04△

4　討　論

Bcl-2與凋亡密切相關(guān)，是目前研究較為透徹的一個(gè)基因家族。Bcl-2家族的成員通常以二聚體的形式發(fā)揮作用。在控制細(xì)胞生存和死亡中起重要作用［7］。很多研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在潰瘍修復(fù)過(guò)程中也起著重要的調(diào)控作用［8］。細(xì)胞凋亡是涉及基因調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，其中Bcl-2可能是調(diào)控胃潰瘍胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡的主要基因［9］。本實(shí)驗(yàn)研究表明，潰瘍模型組中的Bcl-2基因蛋白表達(dá)明顯低于正常組，而柴芍胃炎顆粒組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加。在潰瘍修復(fù)后，Bcl-2蛋白基本可恢復(fù)至正常水平表達(dá)。說(shuō)明柴芍胃炎顆粒治愈胃潰瘍的機(jī)制與減少胃黏膜細(xì)胞的凋亡，增加抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

NF-κB是參與炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子，在生理狀態(tài)下，它與κB抑制蛋白（IκB）結(jié)合以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)其受內(nèi)毒素、氧自由基、細(xì)胞因子等的刺激后被激活，導(dǎo)致IκB磷酸化降解，NF-κB 與IκB解離，快速?gòu)募?xì)胞質(zhì)移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)自身核定位序列與相應(yīng)的靶序列結(jié)合，調(diào)控相應(yīng)的靶基因表達(dá)，調(diào)控多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)節(jié)炎癥進(jìn)程，如調(diào)控黏附分子、前炎癥介質(zhì)、趨化因子和一些炎性相關(guān)酶類的過(guò)度或持續(xù)表達(dá)，而使大量的炎性細(xì)胞積聚浸潤(rùn)于炎癥部位，導(dǎo)致持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)［10］。有研究表明，消化性潰瘍其胃黏膜上皮細(xì)胞NF-κB的活性是明顯增加的，且NF-κB陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與炎癥程度呈明顯相關(guān)［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組大鼠胃黏膜有極少NF-κB陽(yáng)性表達(dá)，乙酸誘導(dǎo)胃潰瘍后，胃黏膜NF-κB激活，引發(fā)胃黏膜炎癥反應(yīng)，參與潰瘍發(fā)生，NF-κB活化表達(dá)與潰瘍指數(shù)呈正相關(guān)，提示其可能是影響潰瘍發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。胃炎顆粒組和奧美拉唑組NF-κB表達(dá)明顯低于模型組，胃炎顆粒組潰瘍指數(shù)均顯示減低，說(shuō)明柴芍胃炎顆?？赏ㄟ^(guò)抑制NF-κB激活和表達(dá)，減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)，促進(jìn)潰瘍愈合。

柴芍胃炎顆粒是我科已故四川名老中醫(yī)周德端教授的經(jīng)驗(yàn)方。方中柴胡具有解熱，抗炎，促進(jìn)免疫功能；芍藥能抑制Hp，從而減輕炎癥，促進(jìn)病變組織修復(fù)；黃連的主要成分為小蘗堿，抗菌譜廣，對(duì)Hp抑菌力較強(qiáng)，并能抗乙酰膽堿，有解痙鎮(zhèn)痛作用；丹參活血化瘀，通絡(luò)止痛，用丹參活血化瘀能增加黏膜組織的循環(huán)灌注促進(jìn)其能量代謝，保證黏膜上皮及潰瘍底部和邊緣腺體迅速再生及保持黏膜微循環(huán)的酸堿平衡等，從而提高潰瘍愈合質(zhì)量［12］。

本研究表明，柴芍胃炎顆粒對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍療效顯著，通過(guò)提高胃黏膜組織中Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)以減少細(xì)胞凋亡，降低胃黏膜組織中NF-κB陽(yáng)性表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)，最終達(dá)到修復(fù)潰瘍的目的，可能是其促進(jìn)潰瘍愈合的重要機(jī)制之一。

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［收稿日期］2015-07-27

［通訊作者］楊偉興

［基金項(xiàng)目］瀘醫(yī)院科（2013）60號(hào)瀘州醫(yī)學(xué)院-瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院聯(lián)合基金課題

［中圖分類號(hào)］R256.337.31

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］B

［文章編號(hào)］1004-2814（2015）12-1086-03