丁苯酞預(yù)處理對(duì)大鼠缺血/再灌注腎損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

薛建峰,段魯勤※，孫海棚

(泰安市中心醫(yī)院 a.老年病二科,b.泌尿內(nèi)科，山東 泰安 271000)

丁苯酞預(yù)處理對(duì)大鼠缺血/再灌注腎損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究

薛建峰a,段魯勤a※，孫海棚b

(泰安市中心醫(yī)院 a.老年病二科,b.泌尿內(nèi)科，山東 泰安 271000)

摘要：目的探討丁苯酞對(duì)SD大鼠腎臟缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用。方法將60只SD大鼠采用隨機(jī)排列表分組法分為對(duì)照組、預(yù)處理組(單純丁苯酞灌胃)、假手術(shù)組、預(yù)處理手術(shù)組(丁苯酞灌胃并雙腎腎動(dòng)脈夾閉手術(shù))、手術(shù)組(單行雙腎腎動(dòng)脈夾閉手術(shù))，每組12只。預(yù)處理組和及預(yù)處理手術(shù)組造模前給予丁苯酞80 mg/(kg·d)灌胃2周，制備SD大鼠腎臟缺血/再灌注急性腎損傷(AKI)模型。檢測(cè)各組大鼠在缺血/再灌注24 h時(shí)血肌酐、尿素氮變化情況，蘇木精-伊紅染色觀察腎臟病理。結(jié)果假手術(shù)組、預(yù)處理手術(shù)組和手術(shù)組尿素氮水平分別為(8.9±1.6)、(33.2±7.7)、(44.9±17.3) mmol/L，顯著高于對(duì)照組的(6.1±1.2) mmol/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但預(yù)處理手術(shù)組尿素氮低于手術(shù)組(P<0.05)；預(yù)處理手術(shù)組和手術(shù)組血肌酐水平分別為(246±50) μmol/L、(318±81) μmol/L，顯著高于對(duì)照組的(43±5) μmol/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但預(yù)處理手術(shù)組低于手術(shù)組(P<0.05)。預(yù)處理手術(shù)組和手術(shù)組病理?yè)p傷評(píng)分分別為(2.4±0.7)分、(3.0±0.6)分，其余3組數(shù)為0分，但預(yù)處理手術(shù)組腎臟損傷程度低于手術(shù)組(P<0.05)。結(jié)論丁苯酞預(yù)處理對(duì)缺血/再灌注性AKI大鼠模型腎功能具有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：缺血/再灌注損傷；急性腎損傷；丁苯酞

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是多種病因引起的腎小球?yàn)V過(guò)率急劇下降，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物無(wú)法排出，進(jìn)而在血液中聚集的一種綜合征，是臨床常見(jiàn)危重癥。其中缺血/再灌注損傷是AKI的主要病因之一。缺血/再灌注性AKI是臨床中各種外科手術(shù)，特別是心臟體外循環(huán)術(shù)常見(jiàn)的術(shù)后并發(fā)癥[1-3]。丁苯酞又稱芹菜甲素，是一種具有線粒體保護(hù)功能的微循環(huán)重構(gòu)劑，研究證實(shí)丁苯酞對(duì)心、腦等組織的缺血/再灌注損傷具有很好的預(yù)防作用[4]。本研究旨在從動(dòng)物模型的角度探討丁苯酞對(duì)腎臟缺血/再灌注性AKI的保護(hù)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1動(dòng)物60只健康SD雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量180~250 g，分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)。購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001，無(wú)特定病原體級(jí)。采用隨機(jī)排列表法分為5組：對(duì)照組、預(yù)處理組(單純丁苯酞灌胃)、假手術(shù)組、預(yù)處理手術(shù)組(丁苯酞灌胃并雙腎腎動(dòng)脈夾閉手術(shù))、手術(shù)組(單行雙腎腎動(dòng)脈夾閉手術(shù))，每組12只。

1.2試劑與儀器丁苯酞(恩必普，石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司)、水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、血肌酐、尿素氮生化試劑盒(瑞士Roche)、石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica EG1150H)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)LEICA-RM-2245)；顯微鏡(日本Nikon eclipase 55i)、Imagepro-Plus軟件病理圖文分析系統(tǒng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法預(yù)處理組及預(yù)處理手術(shù)組于術(shù)前2周開始按80 mg/(kg·d)丁苯酞灌胃；非手術(shù)組、對(duì)照組和假手術(shù)組于術(shù)前2周開始給予等體積生理鹽水灌胃。

1.3.1缺血/再灌注腎損傷模型制備10%水合氯醛300 mg/kg行腹腔麻醉。將麻醉后大鼠仰臥位固定于37 ℃恒溫床上，備皮；劍突下約1橫指腹部正中偏縱行切開皮膚，切口長(zhǎng)約4 cm，腹白線切開筋膜層及肌層，使用右手食指入左側(cè)腹腔翻出大鼠左側(cè)腎臟，棉簽分離腎蒂周圍脂肪組織，暴露腎動(dòng)脈，使用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉腎動(dòng)脈，待腎臟顏色變淡及腎臟包膜皺縮后表示夾閉成功，同樣方法夾閉右腎，兩側(cè)腎臟夾閉時(shí)間間隔約為1 min。夾閉成功后將雙腎暫時(shí)還納入腹腔，溫生理鹽水紗布覆蓋切口，將大鼠放入37 ℃恒溫毯中。腎動(dòng)脈血流阻斷45 min后，松開動(dòng)脈夾，可見(jiàn)紫黑色腎臟首先出現(xiàn)花斑樣變色，后變?yōu)榉奂t色，表示模型制造成功。雙腎復(fù)位，腹腔注射2 mL溫生理鹽水后關(guān)腹。將大鼠放入37 ℃保溫毯中待其蘇醒。假手術(shù)組為麻醉后開腹翻出腎臟，不進(jìn)行雙腎動(dòng)脈夾閉。

1.3.2制備石蠟切片雙腎血流恢復(fù)后24 h，將大鼠麻醉，取其血清及腎臟組織。將腎組織切成1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm大小的組織塊，4%甲醛溶液固定48 h；后使用75%乙醇15 min×2次、95%乙醇20 min×3次、無(wú)水乙醇50 min、無(wú)水乙醇60 min浸泡脫水。后多次浸泡于75%乙醇及無(wú)水乙醇脫水。脫水后的標(biāo)本浸泡于二甲苯溶液中20 min×2次透明。透明后的組織依置于3杯石蠟中浸泡20 min、30 min和60 min后包埋成蠟塊，將蠟塊切成2 μm厚的切片，在38 ℃水浴箱中展片并鋪于玻片上標(biāo)記，將玻片在55 ℃烤片機(jī)上烤片1 h，置于烘箱中烘烤過(guò)夜。

1.3.3蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE染色)將切片脫蠟后依次使用無(wú)水乙醇、95%乙醇及蒸餾水洗片，使用蘇木精染色10 min，蒸餾水洗片至組織呈灰色，使用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒后再次洗片，用伊紅染色10 min，再經(jīng)無(wú)水乙醇及二甲苯洗片后使用中性樹膠封片。

1.3.4腎功能損傷評(píng)定光鏡下(200×)在每個(gè)標(biāo)本的外髓外帶隨機(jī)選取至少40個(gè)不重疊視野。以腎小管擴(kuò)張、上皮細(xì)胞脫落，或腎小管基膜裸露為腎小管損傷標(biāo)志，根據(jù)受損腎小管占觀察單位的比例進(jìn)行評(píng)分，0分：無(wú)腎小管損傷；1分：損傷腎小管比例<20%；2分：損傷腎小管比例21%~50%；3分：損傷腎小管比例50%~75%；4分：損傷腎小管比例>75%[5]。

2結(jié)果

2.1各組SD大鼠尿素氮、血肌酐比較假手術(shù)組、預(yù)處理手術(shù)組、手術(shù)組尿素氮水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，但預(yù)處理手術(shù)組尿素氮低于手術(shù)組(P<0.05)；預(yù)處理手術(shù)組和手術(shù)組血肌酐水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，但預(yù)處理手術(shù)組低于手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　各組SD大鼠尿素氮、血肌酐比較　±s)

a與對(duì)照組比較，P<0.05；b與預(yù)處理手術(shù)組比較，P<0.05

2.2大鼠腎臟組織病理學(xué)變化對(duì)照組大鼠腎臟HE染色(圖1A)腎小球無(wú)明顯病變，毛細(xì)血管袢開放良好，內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞無(wú)增生或壞死；而預(yù)處理手術(shù)組和手術(shù)組的腎臟肉眼及可見(jiàn)明顯的皮髓質(zhì)交界處充血缺血帶，HE染色，鏡下可見(jiàn)病變主要位于外髓外帶近端小管，近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣廣泛脫落，細(xì)胞腫脹、空泡變性，腎小管基膜裸露、管腔內(nèi)有大量脫落的上皮細(xì)胞碎片，部分可見(jiàn)遠(yuǎn)端小管內(nèi)上皮細(xì)胞管型(圖1B、圖1C)。5組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟損傷最為嚴(yán)重的是手術(shù)組,病理?yè)p傷評(píng)分為(3.0±0.6)分，其次為預(yù)處理手術(shù)組為(2.4±0.7)分，其余3組腎臟無(wú)明顯病理學(xué)變化,病理?yè)p傷評(píng)分均為0分。預(yù)處理手術(shù)組較手術(shù)組降低了近20%(F=2.24,P=0.035)。

圖1　SD大鼠腎臟組織病理學(xué)變化(HE染色 ×200)　A：對(duì)照組；B：預(yù)處理手術(shù)組；C：手術(shù)組

3討論

目前AKI早期診斷已取得部分進(jìn)展，但在AKI的早期預(yù)防方面尚需進(jìn)一步研究，本研究以丁苯酞為研究對(duì)象，使用最為常用有效的缺血/再灌注性AKI大鼠模型，探討丁苯酞對(duì)AKI的預(yù)防保護(hù)作用。這種模型血肌酐會(huì)在再灌注后24 h內(nèi)達(dá)到高峰，因此本研究選擇這個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集模型鼠的血清和腎臟組織進(jìn)行對(duì)比研究，結(jié)果顯示，預(yù)處理手術(shù)組的模型鼠腎功能下降程度低于手術(shù)組，腎臟損傷評(píng)分也降低，表明預(yù)防性使用丁苯酞能對(duì)AKI模型鼠的腎臟發(fā)揮一定的預(yù)防作用。實(shí)驗(yàn)中假手術(shù)組大鼠血清尿素氮水平出現(xiàn)輕度上升，血肌酐升高明顯，分析可能的原因?yàn)榧偈中g(shù)組大鼠雖未行動(dòng)脈夾閉，但在手術(shù)過(guò)程中，腹腔內(nèi)臟的暴露及血液的流失導(dǎo)致大鼠體循環(huán)血量的降低，而大鼠在手術(shù)結(jié)束后又有一段時(shí)間麻醉蘇醒過(guò)程，不能及時(shí)補(bǔ)充體循環(huán)血量，致使腎功能出現(xiàn)輕度下降。

腎臟的再灌注損傷是心臟體外循環(huán)術(shù)心臟復(fù)跳后常見(jiàn)的并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為血肌酐的升高，病理表現(xiàn)為線粒體的腫脹、變形、崩解。血肌酐輕度升高會(huì)增加患者病死率并延長(zhǎng)住院時(shí)間，其中25%的患者需要行連續(xù)性腎臟替代治療。因此，早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防成為AKI治療的關(guān)鍵。作為一種快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)，缺血/再灌注損傷廣泛存在于心、腦、肝、腎、胃腸道等器官[6]，可能的機(jī)制包括白細(xì)胞、自由基的作用、鈣超載、興奮性氨基酸毒性等。發(fā)病過(guò)程涉及多個(gè)凋亡相關(guān)基因[7]，凋亡方式主要涉及非caspase依賴路徑及caspase依賴路徑[8]。丁苯酞是我國(guó)科學(xué)家從芹菜籽中提取的有效成分，商品名稱為恩必普，作為治療急性腦梗死的有效藥物，被寫進(jìn)《2010年中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南》。經(jīng)研究，丁苯酞通過(guò)重構(gòu)腦血循環(huán)，增加缺血區(qū)灌注，保護(hù)線粒體，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡來(lái)治療急性腦卒中，其機(jī)制是丁苯酞能對(duì)凋亡途徑中關(guān)鍵的caspase-3蛋白發(fā)揮抑制作用，進(jìn)而阻斷多個(gè)缺血/再灌注性病理環(huán)節(jié)，改善缺血區(qū)微循環(huán)，保護(hù)線粒體能量泵，并阻止氧糖剝奪后導(dǎo)致的線粒體損害及細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)腦細(xì)胞的目的[9]。

本研究受到丁苯酞治療腦梗死取得良好效果的啟發(fā)，在大鼠缺血/再灌注性腎臟損傷模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用丁苯酞對(duì)其進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，預(yù)防應(yīng)用丁苯酞對(duì)缺血/再灌注性腎臟損傷具有一定保護(hù)作用。其可能的機(jī)制包括提高缺血區(qū)血流量；抗氧化減少細(xì)胞凋亡；改善線粒體腫脹和空泡化。雖然本研究的思路是創(chuàng)新性的，但未能對(duì)丁苯酞預(yù)防AKI機(jī)制進(jìn)行更深入的研究，且未進(jìn)行動(dòng)態(tài)學(xué)觀察，希望在以后的研究中進(jìn)一步完善。

參考文獻(xiàn)

[1]Garg AX,Devereaux PJ,Yusuf S,etal.Kidney function after off-pump or on-pump coronary artery bypass graft surgery:a randomized clinical trial[J].JAMA,2014,311(21):2191-2198.

[2]Kim JD,Chee HK,Shin JK,etal.Novel early predictor of acute kidney injury after open heart surgery under cadiopulmonary bypass using plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin[J].Korean J Thorac Cardiovasc Surg,2014,47(3):240-248.

[3]Chertow GM,Burdick E,Honour M,etal.Acute kidney injury,mortality,length of stay,and costs in hospitalized patients[J].J Am Soc Nephrol，2005,16(11):3365-3370.

[4]Liao SJ,Lin JW,Pei Z,etal.Enhanced angiogenesis with dl-3n-butylphthalide treatment after focal cerebral ischemia in RHRSP[J].Brain Res,2009,1289(15):69-78.

[5]戎曼，吉程程，胡惠民.胱抑素C在缺血/再灌注急性腎損傷大鼠尿液中的變化及意義[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2009，10(7)：570-572.

[6]王建枝,殷蓮華.病理生理學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:152.

[7]Broughton BR,Reutens DC,Sobey CG.Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia[J].Stroke,2009,40(5):e331-339.

[8]Cho BB,Toledo-Pereyra LH.Caspase-independent programmed cell death following ischemic stroke[J].J Invest Surg,2008,21(3):141-147.

[9]Li J,Li Y，Ogle M,etal.DL-3-n-butylphthalide prevents neuronal cell death after focal cerebral ischemia in mice via the JNK pathway[J].Brain Res,2010,1359(4):216-226.

Experimental Study of the Protective Effect of Butylphthalide Preconditioning on Ischemia Reperfusion Renal Injury in Rat

XUEJian-fenga，DUANLu-qina，SUNHai-pengb.

(a.theSecondSectionofDepartmentofGeriatricMedicine，b.DepartmentofUrology,Tai′anCentralHospital，Shandong,Tai′an271000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effect of the preventive application of butylphthalide on ischemia reperfusion renal injury in SD rats.MethodsA total of 60 SD rats were randomly divided into control group,pretreatment group(simple butylphthalide gavage),sham operation group,pretreatment operation group(butylphthalide gavage and double renal artery clipping operation),operation group (single pair of renal artery clipping operation) by random arrangement table，with 12 rats in each group.Rats in pretreatment group and pretreatment operation group were given butylphthalide 80 mg/(kg·d) to gavage for 2 weeks before modelling,to prepare SD rat model of renal ischemia reperfusion acute renal injury.Changes of blood creatinine,uremic nitrogen at 24 h of ischemia reperfusion of all the groups were detected,and renal pathological results were observed by hematoxylineosin staining.ResultsUrea nitrogen levels of the sham operation group,pretreatment operation group and operation group were (8.9±1.6) mmol/L,(33.2±7.7) mmol/L,(44.9±17.3) mmol/L，significantly higher than (6.1±1.2) mmol/L of the control group,the differences were statistically significant(P<0.01)，but the urea nitrogen level of pretreatment operation group was lower than operation group(P<0.01).Blood creatinine level of the pretreatment operation group and operation group were (246±50) μmol/L，(318±81) μmol/L, significantly higher than (43±5) μmol/L of the control group, the differences were statistically significant(P<0.01),but the blood creatinine level of pretreatment operation group was lower than operation group(P<0.01).Pathological injury scores of the pretreatment operation group and operation group were (2.4±0.7) scores，(3.0±0.6) scores,significantly higher than 0 score of the control group,the differences were statistically significant(P<0.01),but pathological injury score of pretreatment operation group was lower than operation group(P<0.01).ConclusionThe preventive application of butylphthalide has a protective effect on renal function of ischemia reperfusion acute kidney injury in SD rat model.

Key words:Ischemia-reperfusion injury; Acute kidney injury; Butylphthalide

收稿日期：2014-10-27修回日期：2015-03-06編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.045

中圖分類號(hào)：R969.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1006-2084(2015)10-1852-03