黃龍止咳口服液對咳嗽變異性哮喘模型大鼠白細胞介素4和γ干擾素的影響

陶迪等

[摘要] 目的 通過測定與分析各組大鼠血清及肺泡灌洗液（BALF）中γ干擾素（IFN-γ）、白細胞介素4（IL-4）含量，觀察黃龍止咳口服液對咳嗽變異性哮喘（CVA）模型大鼠免疫功能的影響，進而探討黃龍止咳口服液調(diào)節(jié)CVA免疫功能紊亂的作用機制。 方法 利用卵蛋白（OA）和氫氧化鋁共同激發(fā)致敏建立CVA大鼠模型，將大鼠分為正常組、模型組、黃龍高劑量組、黃龍中劑量組、黃龍低劑量組、先聲咳喘寧組、布地奈德組，記錄引喘誘咳時2 min內(nèi)大鼠咳嗽次數(shù)及血清和支氣管BALF中IL-4、IFN-γ含量。 結(jié)果 與正常組比較，模型組咳嗽次數(shù)明顯增多（P < 0.01），血清和支氣管BALF中IL-4含量顯著升高（P < 0.01），IFN-γ含量降低（P < 0.01）；與模型組比較，各治療組咳嗽次數(shù)均明顯減少（P < 0.01），血清及BALF中IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；黃龍高劑量組與黃龍低、中劑量組比較，咳嗽次數(shù)明顯減少，血清及BALF中IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）；與先聲咳喘寧組比較，黃龍高劑量組血清IFN-γ值相對升高，BALF中IL-4值相對降低，IFN-γ值相對升高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；與布地奈德組比較，黃龍高劑量組血清IFN-γ值相對升高，BALF中IL-4值相對降低，IFN-γ值相對升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 黃龍止咳口服液通過降低機體的IL-4含量、升高IFN-γ含量發(fā)揮治療CVA的作用。

[關(guān)鍵詞] 咳嗽變異性哮喘；白細胞介素-4；γ干擾素；支氣管肺泡灌洗液；黃龍止咳口服液

[中圖分類號] R562.25 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）01（b）-0008-05

Effect of Huanglong Cough Liquid on interleukin-4 and interferon-γ of cough variant asthma of model rats

TAO Di1 SI Zhenyang2▲ LONG Hongyan3 ZHANG Biao2

1.Graduate School， Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210029， China； 2.Department of Pediatrics， Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210001， China； 3.Central Laboratory， Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Jiangsu Province， Nanjing 210001， China

[Abstract] Objective By measuring and analyzing the content of interferon-γ （IFN-γ）， interleukin-4 （IL-4） of serum and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） in rats of all groups， to observe the effect of Huanglong Cough Liquid on immunologic function of cough variant asthma （CVA） of model rats， so as to investigate the mechanism of Huanglong Cough Liquid in adjusting the immune dysfunction of CVA. Methods The egg albumin （OA） and aluminum hydroxide were used to motivate sensitization to establish CVA model of rats， and the rats were divided into normal group， model group， high dose of Huanglong group， medial dose of Huanglong group， low dose of Huanglong group， Xiansheng Kechuanning group， Budesonide group. The cough times and contents of IFN-γ， IL-4 of serum and bronchus BALF at inducing dyspnea with cough whin 2 min were recorded. Results Compared with normal group， the cough times of model group were increased significantly （P < 0.01）， the content of IL-4 of serum and bronchus BALF was increased significantly （P < 0.01）， the content of IFN-γ was decreased significantly （P < 0.01）； compared with model group， the cough times of all groups decreased significantly （P < 0.01）， the content of IL-4 of serum and BALF was decreased significantly， the content of IFN-γ was increased significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）； compared with low， medial dose of Huanglong group， the cough times of high dose of Huanglong group were decreased significantly， the content of IL-4 of serum and bronchus BALF was decreased significantly， the content of IFN-γ was increased significantly， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）； compared with Xiansheng Kechuanning group， the content of serum IFN-γ of high dose of Huanglong group was increased relatively， the content of IL-4 of BALF was decreased relatively， the content of IFN-γ was increased relatively， the differences were statistically significant （P < 0.01）； compared with Budesonide group， the content of serum IFN-γ of high dose of Huanglong group was increased relatively， the content of IL-4 of BALF was decreased relatively， the content of IFN-γ was increased relatively， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Huanglong Cough Liquid play a treatment role in CVA by decreasing the contents of IL-4 and increasing the contents of IFN-γ.

[Key words] Cough variant asthma； Interleukin 4； Interferon-γ； Bronchoalveolar lavage fluid； Huanglong Cough Liquid

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是哮喘的一種潛在形式或特殊類型?，F(xiàn)代中醫(yī)文獻根據(jù)發(fā)病特點及臨床表現(xiàn)將其命名為“哮咳”、“風咳”等。目前多數(shù)學(xué)者認為CVA與典型哮喘的發(fā)病機制相同，研究表明[1-2]：CVA與多種炎癥細胞、炎癥介質(zhì)、細胞因子共同參與相互作用所致的慢性非特異性炎癥的病理基礎(chǔ)相吻合，其間接表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性。新近研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，輔助性T淋巴細胞亞群（Th細胞）功能紊亂，可能是支氣管哮喘發(fā)病中的一個重要環(huán)節(jié)。而Th細胞根據(jù)所分泌的細胞因子的不同，可進一步分為Th1和Th2兩個亞型，γ干擾素（IFN-γ）、白介素4（IL-4）分別是Th1和Th2的細胞因子。因此，研制具有調(diào)節(jié)IFN-γ/IL-4免疫功能的中藥有重要意義。本實驗通過觀察黃龍止咳口服液對CVA模型動物血清和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中IL-4、IFN-γ水平的影響，探討CVA發(fā)病機制和黃龍止咳口服液的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級Wistar 大鼠（160～200 g）80只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 藥物 黃龍止咳口服液，由炙麻黃、地龍、杏仁、紫蘇子、桑白皮、前胡、旋覆花、蟬蛻組成，購自南京市中醫(yī)院藥劑科，用蒸餾水煎至生藥1.5 kg/L，4℃冰箱保存。先聲咳喘寧：江蘇先聲制藥有限公司，國藥準字Z32020967，規(guī)格10 mL/支。吸入用布地奈德混懸液（普米克令舒）：澳大利亞阿斯利康有限公司，批號3144771，規(guī)格1 mg/2 mL。

1.1.3 試劑 氫氧化鋁干粉： 南京市中醫(yī)院藥劑科提供。卵蛋白（OA）：美國Sigma 公司（批號1001581887）；辣椒素（純度>95%）：南京都萊生物技術(shù)有限公司（批號19404-86-4），取辣椒素30.5 mg，用吐溫-80溶液及無水乙醇各1 mL溶解，加入生理鹽水并稀釋成1×10-4 mol/L溶液；IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒：聯(lián)科生物科技有限公司（批號：230430312）；IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒：聯(lián)科生物科技有限公司（批號238030312）。

1.1.4 器材 402AI超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司）；自動洗板機（Bio-Tek ELX50）；酶標分析儀（Bio-Tek Epoch）。

1.2 方法

1.2.1 CVA動物模型的建立 采用卵蛋白和氫氧化鋁共同激發(fā)致敏的方法造模。將除正常組10只大鼠外，其余以配制的含卵蛋白1 mg和氫氧化鋁10 mg的生理鹽水1 mL作皮下注射。分別在兩后足跖、腹股溝、腰、背、頸部共取10點，每點皮下注射0.05 mL，同時腹腔注射0.5 mL，共計1 mL，第8天重復(fù)1次以加強致敏。從第15天起，將大鼠置于密閉有機玻璃罩內(nèi)，給予含1%OA溶液的生理鹽水超聲霧化激發(fā)20 min，以激發(fā)哮喘，以大鼠腹肌明顯收縮為陽性，直到出現(xiàn)呼吸加深、加快等呼吸道痙攣癥狀，提示造模成功[5]。

1.2.2 分組與給藥 將造模成功的大鼠隨機分為7組（正常組、模型組、布地奈德組、先聲咳喘寧組、黃龍高劑量組、黃龍中劑量組、黃龍低劑量組），每組10只。黃龍止咳口服液低、中、高劑量組給藥濃度為0.75、1.5、3.0 kg/L；先聲咳喘寧口服液組4.2 mL/kg灌胃給藥；布地奈德組（0.12 mL/kg）配以等量的生理鹽水霧化吸入給藥；正常組及模型組同步用1 mL/100 g蒸餾水灌胃。大鼠給藥劑量按60 kg成人體表面積換算而來。連續(xù)給藥14 d，第15天處死動物。

1.2.3 指標檢測 ①咳嗽次數(shù)測定方法：將每組大鼠放置在密閉箱內(nèi)，記錄2 min內(nèi)霧化吸入濃度為1×10-4 mol/L辣椒素溶液后的咳嗽次數(shù)，將給藥2、4、6 d內(nèi)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計測定。②血清中IL-4、IFN-γ的含量：腹主動脈取血4 mL，標本由無菌干燥管收集，靜置1 h后，4℃ 2000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃以下保存，測定方法嚴格按照酶聯(lián)免疫試驗試劑盒說明書操作。③BALF中IL-4、IFN-γ的含量：左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)，分3次進行，分別灌入生理鹽水4、3、3 mL，共計10 mL。將3次收集的BALF混合均勻，再以1500 r/min離心5 min，取上清液，-20°C保存，測定方法嚴格按照酶聯(lián)免疫試驗試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 16.0軟件，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；除正常對照外，其余各組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠咳嗽次數(shù)的測定結(jié)果比較

用藥后第2、4、6天，與正常組比較，模型組咳嗽次數(shù)明顯增多（P < 0.01），提示造模成功。用藥后第2、4、6天，各治療組咳嗽次數(shù)與模型組比較均明顯減少（P < 0.01），提示各治療組藥物都具有止咳的功效。用藥后第6天，黃龍各劑量組與先聲咳喘寧組、布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），提示治療組藥物之間止咳作用程度相似。黃龍高劑量組與低、中劑量組比較差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），提示黃龍止咳口服液在改善咳嗽癥狀方面呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

2.2 各組大鼠血清中IL-4和IFN-γ的檢測結(jié)果比較

與正常組比較，模型組血清IL-4值明顯升高，而IFN-γ值明顯降低（P < 0.01），提示IL-4、IFN-γ與CVA的發(fā)病密切相關(guān)；與模型組比較，各治療組的血清IL-4值明顯降低，IFN-γ值明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），提示各治療組均對CVA有一定的治療作用；與黃龍高劑量組比較，先聲咳喘寧組IFN-γ值相對降低（P < 0.01）；布地奈德組IFN-γ值相對降低（P < 0.05），提示在調(diào)節(jié)血清IFN-γ含量水平，黃龍高劑量組優(yōu)于先聲咳喘寧和布地奈德組；黃龍高劑量組IL-4和IFN-γ含量與其低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），提示在調(diào)節(jié)血清中顯示一定的量-效關(guān)系。

2.3 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-4和IFN-γ含量的檢測結(jié)果比較

與正常組比較，模型組BALF中IL-4值明顯升高，而IFN-γ值明顯降低（P < 0.01），提示CVA發(fā)病可影響B(tài)ALF中IL-4和IFN-γ的含量；與模型組比較，各治療組BALF中IL-4明顯降低，IFN-γ明顯升高（P < 0.05或P < 0.01），提示各治療組均能起到一定的治療作用；與黃龍高劑量組比較，先聲咳喘寧組、布地奈德組BALF中IL-4值相對升高，IFN-γ值相對降低（P < 0.01），提示黃龍治療組在調(diào)節(jié)BALF中IL-4和IFN-γ含量優(yōu)于其他治療組；黃龍高劑量組與低、中劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01），顯示一定的量-效關(guān)系。

3 討論

本方在中醫(yī)整體觀念、辨證論治原則的指導(dǎo)下，針對CVA患兒的病機多為風痰痹阻、肺熱氣逆的特點，確定了祛風解痙、宣肺化痰、清氣降逆的基本治法，方中炙麻黃有宣肺平喘、祛風降氣之功；地龍有清肺平肝、平喘通絡(luò)之功，為清熱解痙、止咳平喘之要藥，兩藥相合宣降并舉、解痙平喘，使肺氣宣達通暢，則咳自止喘自平，共為君藥。杏仁有宣肺降氣、止咳化痰之功。紫蘇子有利肺平喘、下氣止咳之功。桑白皮有清肺泄熱、止咳平喘之功。前胡有宣肺降氣、降氣化痰之功，四者均為臣藥。旋覆花、蟬蛻為佐使之藥，其中旋覆花有降氣消痰、和中止逆之功，為治療嗆咳之要藥。蟬蛻有清熱宣肺、祛風解痙之功，為治療刺激性干咳與痙咳之要藥。諸藥合用，宣降同施，溫潤并用，相輔相成，共奏清熱宣肺、祛風解痙、順氣化痰、降逆止咳之功，使風去熱清、氣順痰消而咳嗽自愈。本課題前期研究結(jié)果表明[6]，黃龍方治療小兒CVA（風熱夾痰證）在改善患兒總體療效、主癥、次癥及證候等諸方面均優(yōu)于對照組，顯示了中醫(yī)藥治療本病的優(yōu)勢。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認為[7-8]，CVA其發(fā)病與免疫因素有關(guān)。細胞免疫方面發(fā)現(xiàn)哮喘的免疫功能實質(zhì)是Th1/Th2亞群功能失調(diào)，表現(xiàn)為Th1功能不足，Th2功能亢進。研究表明[9]，糾正Th1/Th2功能失衡，可以減輕氣管哮喘的癥狀。IFN-γ在支氣管哮喘中起保護作用，在Th1細胞因子中具有促進炎性反應(yīng)，較強的抗病毒、抗細菌感染和抗寄生蟲感染，加強宿主的防御和參與免疫調(diào)節(jié)的作用，其分泌減少與哮喘的發(fā)生關(guān)系密切[10-11]。而Th2主要分泌IL-4等細胞因子與IgE合成、嗜酸細胞的浸潤和激活密切相關(guān)，參與CVA變應(yīng)性炎癥的發(fā)生和發(fā)展，被認為是Th2轉(zhuǎn)化的必需因子，并抑制Th1細胞的效應(yīng)功能[12]。

CVA患兒以咳嗽為主要臨床表現(xiàn)。實驗結(jié)果顯示模型組大鼠的咳嗽次數(shù)多于正常組（P < 0.01），證實造模成功。用藥后第2天，各治療組咳嗽次數(shù)與模型組比較均減少（P < 0.01），說明各治療組均有效緩解CVA大鼠的咳嗽癥狀。用藥后第6天，黃龍各劑量組與先聲咳喘寧組、布地奈德組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），說明治療組藥物之間止咳作用程度相似。黃龍劑量組間比較，高劑量組與低、中劑量組比較有顯著性差異（P < 0.01），說明隨著黃龍劑量的增加，止咳效果更加明顯。

對血清中IL-4、IFN-γ含量的影響實驗結(jié)果顯示：連續(xù)給藥治療14 d后，與模型組比較，各治療組血清IL-4指標含量明顯降低、IFN-γ含量升高（P < 0.01），說明IL-4、IFN-γ與CVA的發(fā)病密切相關(guān)。治療方面，黃龍高劑量組與低、中劑量組比較，IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高（P < 0.05），說明隨著黃龍止咳口服液劑量加大，治療CVA的效果更顯著，黃龍止咳口服液對CVA治療作用具有量效關(guān)系。與先聲咳喘寧組和布地奈德組比較，黃龍高劑量組血清中IFN-γ含量較高，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），而血清中IL-4含量低，無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在調(diào)節(jié)血清IFN-γ含量水平，黃龍高劑量組優(yōu)于先聲咳喘寧和布地奈德組，其調(diào)節(jié)血清中IL-4含量水平與先聲咳喘寧和布地奈德相似。療效方面，與正常組比較，先聲咳喘寧組和布地奈德組在調(diào)節(jié)血清IL-4、IFN-γ的含量有顯著性差異（P < 0.05），說明其一定程度上緩解CVA病情，使其接近正常水平。而黃龍高劑量組與正常組比較無顯著性差異（P > 0.05），說明其療效優(yōu)于其他對照組，從而達到治療CVA的目的。

對支氣管BALF中IL-4、IFN-γ的影響實驗結(jié)果顯示：BALF中IL-4指標含量明顯降低、IFN-γ含量升高，說明BALF中IL-4、IFN-γ的含量水平與CVA的發(fā)病密切相關(guān)。治療方面，黃龍高劑量組與低、中劑量組比較，IL-4含量明顯降低，IFN-γ含量明顯升高，具有顯著性差異（P < 0.05或P < 0.01），說明黃龍止咳口服液對CVA治療作用具有量效關(guān)系。與布地奈德組比較，黃龍高劑量組BALF中IL-4含量低，有顯著性差異（P < 0.01），IFN-γ含量高，但無統(tǒng)計學(xué)差異，說明在調(diào)節(jié)BALF中IL-4水平優(yōu)于布地奈德組，在調(diào)節(jié)IFN-γ水平與其相似。與先聲咳喘寧組比較，黃龍高劑量組BALF中IL-4含量低，IFN-γ含量高，無統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩者通過調(diào)節(jié)BALF中IL-4、IFN-γ含量達到治療CVA的目的水平相似。療效方面，與正常組比較，先聲咳喘寧組和布地奈德組調(diào)節(jié)BALF中IL-4、IFN-γ含量有顯著性差異（P < 0.05），說明其一定程度上緩解CVA病情，使其接近正常水平。而黃龍高劑量組與正常組比較無顯著性差異（P > 0.05），說明其療效優(yōu)于其他對照組，從而達到治療CVA的目的。

從本實驗可以看出，黃龍止咳口服液可以明顯改善CVA咳嗽癥狀，通過調(diào)節(jié)血清及BALF中IFN-γ和IL-4含量達到治療CVA的目的，且療效優(yōu)于其他對照組。與模型組比較，治療組的血清及BALF中IL-4水平降低、IFN-γ水平升高，可能是通過降低機體IL-4水平，升高機體IFN-γ水平，以調(diào)控Th1向Th2細胞分化，引起Th1細胞的減少，從而減輕氣道炎癥，抑制氣道重塑有關(guān)，這可能是黃龍止咳口服液治療CVA的機制之一。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，作用靶點繁多，因此，實驗初步證實了黃龍止咳口服液可調(diào)節(jié)Th1/Th2功能失衡，其治療CVA的深層次機制有待進一步開展。

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（收稿日期：2014-09-19 本文編輯：張瑜杰）