酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定紅細(xì)胞內(nèi)多聚谷氨酸化甲氨蝶呤濃度的方法建立及其初步應(yīng)用

牟方祥 吳紅 王恒 鄒德生 王勇 方勇飛

[摘要] 目的 建立檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（methotrexate polyglutamates，MTXPG）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）方法。 方法 將含有MTXPG的紅細(xì)胞采用凍融法、化學(xué)裂解法、酶法、超聲破碎法等方法裂解，加入血清與裂解液在抗壞血酸、巰基乙醇保護(hù)液作用下將MTXPG轉(zhuǎn)化為甲氨蝶呤（methotrexate，MTX），轉(zhuǎn)化液采用高氯酸、三氯乙酸及飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白，最后將溶液pH值調(diào)整為3.0～9.0，采用ELISA檢測(cè)MTX濃度。經(jīng)方法學(xué)考核后，檢測(cè)臨床標(biāo)本對(duì)方法準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果 發(fā)現(xiàn)凍融法與凍融法裂解紅細(xì)胞顯著優(yōu)于酶法和化學(xué)裂解法（P < 0.05），抗壞血酸配制的保護(hù)液明顯優(yōu)于巰基乙醇（P < 0.05），轉(zhuǎn)化液37℃孵育3 h時(shí)MTXPG轉(zhuǎn)化完全，高氯酸、三氯乙酸、飽和硫酸銨溶液3種蛋白沉淀劑無(wú)明顯差異（P > 0.05），最適pH為6～8，最佳pH值為6.8。濃度在0.2～10.0 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9967），回收率為96.6%～103.3%，RSD為8.0%～14.3%，日內(nèi)差異為1.7%～11.7%，日間差異為7.4%～13.5%，RSD均小于15%。檢測(cè)患者紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度為（64.75±28.45）ng/mL。 結(jié)論 建立的紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG的ELISA法有良好的準(zhǔn)確性和特異性，方法操作簡(jiǎn)單易行，可用于臨床紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度的監(jiān)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 多聚谷氨酸化甲氨蝶呤；甲氨蝶呤；固相酶聯(lián)免疫吸附法；裂解

[中圖分類號(hào)] R593.22 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）01（c）-0091-04

多聚谷氨酸化甲氨蝶呤（methotrexate polyglutamates，MTXPG）是甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物[1]，1973年Baugh等[2]首次報(bào)道在人紅細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)MTXPG，后在人肝臟細(xì)胞中也存在MTXPG[3]。MTX作為一種葉酸拮抗劑，廣泛用于抗腫瘤、免疫抑制、抗風(fēng)濕、異位妊娠等治療[4-8]。MTXPG被認(rèn)為是人體內(nèi)MTX發(fā)揮藥理作用的活性成分[3]，低劑量MTX常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，大約有30%的患者因?qū)TX無(wú)顯著療效或不良反應(yīng)而停止治療[9]，MTX治療缺乏一個(gè)有效的療效及不良反應(yīng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，大部分MTX在24 h被代謝，不能反映MTX的效應(yīng)，MTXPG長(zhǎng)期儲(chǔ)存于患者紅細(xì)胞內(nèi)[9-10]。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MTXPG含量可預(yù)測(cè)MTX的治療效果及藥物不良反應(yīng)。目前MTXPG的常用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法（HPLC）、色譜質(zhì)譜法（LC-MS）、放射免疫分析法（RIA）[6-11]。上述方法準(zhǔn)確度高，但是操作繁瑣，檢測(cè)成本高，且需要特殊設(shè)備儀器，不適用用臨床及基層醫(yī)院開(kāi)展。本課題組前期研究已經(jīng)研發(fā)出生物素-親和素偶聯(lián)放大競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）MTX檢測(cè)試劑盒，本研究結(jié)合MTXPG結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇將紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG體外轉(zhuǎn)為MTX，探索其轉(zhuǎn)化體系、細(xì)胞裂解液、pH值、轉(zhuǎn)化液、細(xì)胞轉(zhuǎn)化溫度及時(shí)間等條件，建立檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG的ELISA方法。

1 儀器與試藥

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 試劑 生物素-親和素偶聯(lián)放大競(jìng)爭(zhēng)ELISA MTX檢測(cè)試劑盒（自制），紅細(xì)胞裂解液（自制），蛋白酶（美國(guó)Sigma公司），MTXPG標(biāo)準(zhǔn)品（瑞士Schircks實(shí)驗(yàn)室），MTX標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品研究所），硫酸銨、巰基乙醇、高氯酸等均為分析純。

1.1.2 儀器 超聲細(xì)胞破碎儀（上海狄非DH96-IIN）、洗板儀（BIOTEK ELX50）、超純水系統(tǒng)（德國(guó)賽多利斯arium）、-80℃超低溫冰箱（日本三洋YL300）、酶標(biāo)儀（BIOTEK ELX800）、恒溫孵育箱（上海儀器廠lw600）、高速離心機(jī)（Eppendorf，ELS）、微量可調(diào)移液器、磁力攪拌器、搖床等。

1.2 樣本來(lái)源

實(shí)驗(yàn)用口服MTX的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者紅細(xì)胞為患者檢測(cè)完血常規(guī)后遺留血樣。

2方法與結(jié)果

2.1 方法原理

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度，檢測(cè)方法的原理是先將紅細(xì)胞裂解，利用血清中γ-谷氨酰水解酶（γ-glutamyl hydrolase，GGH）在轉(zhuǎn)化保護(hù)液的作用下將MTXPG轉(zhuǎn)化為MTX，再用蛋白沉淀劑將反應(yīng)液中蛋白沉淀，最后調(diào)解至適合pH，采用ELISA檢測(cè)MTX濃度，最后計(jì)算出MTXPG濃度。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)考察紅細(xì)胞裂解方式、時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)化保護(hù)液、蛋白沉淀劑、反應(yīng)pH等因素對(duì)檢測(cè)體系的影響，進(jìn)而確定出最適合反應(yīng)體系及條件，并對(duì)方法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行驗(yàn)證。

2.2 紅細(xì)胞裂解方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響

反復(fù)凍融法裂解紅細(xì)胞，取200 μL含MTXPG的紅細(xì)胞分別在-80℃和-20℃下凍存，在37℃和56℃下復(fù)融，觀察不同凍融次數(shù)及凍存、復(fù)融時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響（見(jiàn)圖1A～C），由圖可見(jiàn)：-80℃下凍存10 min，-20℃下凍存60 min，37℃下復(fù)融7 min，56℃下復(fù)融2 min，各個(gè)溫度下凍融2次可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。凍融法、化學(xué)裂解法、酶法、超聲破碎法四種方法裂解紅細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)影響見(jiàn)圖1D，提示反復(fù)凍融法優(yōu)于酶法和化學(xué)裂解法（P < 0.05）中。

2.3 MTXPG轉(zhuǎn)化為MTX條件對(duì)實(shí)驗(yàn)影響

取上述紅細(xì)胞裂解液50 μL與100 μL自體血清1∶2混勻，分別在抗壞血酸和巰基乙醇的保護(hù)液下37℃避光孵育12 h。兩種保護(hù)液對(duì)實(shí)驗(yàn)影響見(jiàn)圖2A，由圖可見(jiàn)：壞血酸配制的保護(hù)液優(yōu)于巰基乙醇（P < 0.05）。在37℃避光孵育30 min及1、2、3、4、5、6、8、10、12 h，觀察不同孵育時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2B，由圖可見(jiàn)，孵育3 h MTXPG可完全轉(zhuǎn)化為MTX。

2.4蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)及溶液pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)影響

將100 μL上述轉(zhuǎn)化液在分別加入10 μL的0.3%高氯酸、10 μL 1%三氯乙酸、100 μL飽和硫酸銨溶液，分別觀察三種蛋白沉淀劑對(duì)實(shí)驗(yàn)影響見(jiàn)圖3A。由圖可見(jiàn)：3種蛋白沉淀劑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。將加完蛋白沉淀劑的轉(zhuǎn)化液混勻，12 000g高速離心5 min，用1 moL/L的氫氧化鈉將上清液pH值調(diào)為3～9，不同pH值下結(jié)果見(jiàn)圖3B，最適pH為6～8，最佳pH值為6.8。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

靈敏度實(shí)驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)MTXPG稀釋成不同濃度，測(cè)得其標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4A，由圖可得靈敏度為0.096 ng/mL，線性方程為Y=-0.7859X+0.9007（r = 0.9967），線性范圍為0.2 ～10.0 ng/mL，其中X為濃度的對(duì)數(shù)值，Y為吸光度。精密度實(shí)驗(yàn)，將標(biāo)準(zhǔn)MTXPG溶液加入空白紅細(xì)胞中，配制為1、2.5、5、7.5 ng/mL 4個(gè)不同濃度水平的待測(cè)樣本，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MTXPG濃度，再與加入濃度相比得出回收率，同一天平行測(cè)量上述樣本5次，連續(xù)測(cè)5 d，1次/d，分別計(jì)算日間及日內(nèi)差異，結(jié)果見(jiàn)表1，回收率為96.6%～103.3%，平均回收率為100.8%，RSD=8.0%～14.3%，平均RSD=10.2%，日內(nèi)差異為1.7%～11.7%，平均RSD=8.4%，日間差異為7.4%～13.5%，平均RSD=9.6%。監(jiān)測(cè)20例口服MTX類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4B，平均MTXPG濃度為（64.75±28.45）ng/mL。

3討論

MTXPG是MTX在葉酰聚谷氨酸合成酶作用下與谷氨酸聚合而成，一個(gè)MTX分子最多可聚合6個(gè)谷氨酸分子，可形成六種不同聚合物，各聚合物分子式相差1～6的谷氨酸[10-13]。MTXPG多存在于細(xì)胞內(nèi)，且含量非常低，同時(shí)分離和檢測(cè)單個(gè)MTXPG聚合物難度非常大[11]。目前常用的檢測(cè)方法為同位素內(nèi)標(biāo)色譜質(zhì)譜法[14]，同位素內(nèi)標(biāo)制備成本高，且其操作繁瑣，需要特殊設(shè)備儀器，不適用于臨床檢測(cè)。有研究者在體外將MTXPG轉(zhuǎn)化為MTX，1分子MTXPG轉(zhuǎn)化為1分子的MTX，采用HPLC測(cè)定總的MTX濃度，可推算出MTXPG濃度[15]。ELISA方法高效、特異、敏感、操作簡(jiǎn)單且無(wú)需特殊儀器，廣泛用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[15]。本課題組擬采用ELISA法檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度。常規(guī)ELISA可檢測(cè)到mg/mL數(shù)量級(jí)，但是紅細(xì)胞中MTXPG含量為ng/mL數(shù)量級(jí)[14-17]。本課題組前期研究已經(jīng)研發(fā)出生物素-親和素偶聯(lián)放大競(jìng)爭(zhēng)ELISA MTX檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度為0.087 ng/mL，檢測(cè)下限為0.2 ng/mL，檢測(cè)線性范圍為0.1～10.0 ng/mL，該方法滿足本課題組要求。本研究結(jié)合MTXPG結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇將紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG體外轉(zhuǎn)為MTX后采用ELISA檢測(cè)的最適條件。

本研究采用凍融法、化學(xué)裂解法、酶法、超聲破碎法四種方法裂解紅細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)凍融法與反復(fù)凍融法顯著優(yōu)于酶法和化學(xué)裂解法（P < 0.05），超聲破碎法需要超聲細(xì)胞破碎儀，考慮到方法可推廣性，筆者采用反復(fù)凍融法裂解紅細(xì)胞。筆者研究?jī)鋈跁r(shí)間、溫度、次數(shù)后發(fā)現(xiàn)，在-80℃下凍存10 min，56℃下復(fù)融2 min 凍融2次可完全裂解紅細(xì)胞?？紤]到部分基層醫(yī)院可能無(wú)-80℃冰箱，筆者研究發(fā)現(xiàn)-20℃下凍存60 min，37℃下復(fù)融7 min凍融2次也可達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。轉(zhuǎn)化保護(hù)液壞血酸配制的保護(hù)液顯著優(yōu)于巰基乙醇（P < 0.05）。在37℃避光孵育3 h MTXPG可完全轉(zhuǎn)化為MTX。高氯酸、三氯乙酸、飽和硫酸銨溶液 3種蛋白沉淀劑無(wú)明顯差異（P > 0.05），最適pH為6～8，最佳pH值為6.8。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用對(duì)數(shù)4參擬合相關(guān)性高達(dá)0.9934，靈敏度為0.096 ng/mL，線性范圍為0.2 ～10.0 ng/mL。精密度試驗(yàn)：回收率為96.6%～103.3%，RSD=8.0%～14.3%，日內(nèi)差異為1.7%～11.7%，日間差異為7.4%～13.5%，RSD均小于15%，滿足臨床檢測(cè)要求[18]。檢測(cè)患者紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度為（64.75±28.45）ng/mL。與國(guó)內(nèi)外研究基本一致[14-15，19]。

本研究采用ELISA方法檢測(cè)紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度，充分利用了ELISA高效、靈敏、特異、低成本、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，建立了體外MTXPG轉(zhuǎn)化MTX、ELISA檢測(cè)MTX的標(biāo)準(zhǔn)方法。該方法有良好的準(zhǔn)確性和特異性，可用于臨床紅細(xì)胞內(nèi)MTXPG濃度監(jiān)測(cè)。

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（收稿日期：2014-10-25 本文編輯：衛(wèi) 軻）