紅陽獼猴桃葉片再生體系的建立

石 瑋， 張 玲， 劉永勝

（合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

0 引 言

獼猴桃又稱豐桃、楊桃、奇異果等［1］，屬雌雄異株植物，倍性復(fù)雜，雌雄株間花期不遇，致使種間雜交困難，育種周期長。而利用扦插、嫁接的方法，成活率較低。文獻［2］首次以獼猴桃莖段為材料，進行離體培養(yǎng)，為獼猴桃組織培養(yǎng)的研究揭開了序幕。目前，世界上獼猴桃生產(chǎn)大國的獼猴桃主要來源于組織培養(yǎng)［3］。通過器官再生和胚胎發(fā)育可對不同的獼猴桃亞種進行再生研究，再生結(jié)果在不同種屬、品種、性別和外植體類型間存在差異［4］。

紅陽獼猴桃是一種新的紅肉獼猴桃，它是中國經(jīng)過近20年的繁育和篩選而獲得的。紅陽獼猴桃鮮果橫剖面沿果心有紫紅色線條，呈放射狀分布，似太陽光芒四射，故稱“紅陽獼猴桃”。其果實短圓柱形，肉質(zhì)鮮嫩，果心小，果味濃，品質(zhì)極佳?？偺堑馁|(zhì)量分數(shù)為13.45%，高出世界流行品種“海沃德”近5%［5］。

本試驗以紅陽獼猴桃組培苗的葉片為材料進行組織培養(yǎng)，優(yōu)化不同激素組合對外植體脫分化和器官再生的影響，以期建立快速有效的繁殖體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養(yǎng)條件

以紅陽獼猴桃組培苗28d葉齡的葉片作為初始外植體。組培苗葉片愈傷組織、不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，不定根的誘導(dǎo)以1／2MS為基本培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度為30g／L（不定根誘導(dǎo)中為20g／L），瓊脂質(zhì)量濃度為7g／L，pH值為5.8。培養(yǎng)條件為光照強度2 500lx，光照時間16h／d，溫度（25±1）℃。每個處理接種6瓶，每瓶接種5個外植體。分別在接種后30d或40d觀察和記錄愈傷組織的發(fā)生，統(tǒng)計不定芽及不定根的分化情況。

1.2 煉苗與移栽

挑選根多且粗壯的植株，擰松瓶蓋于室內(nèi)煉苗3d左右。在瓶內(nèi)加入適量自來水以保持培養(yǎng)基的濕潤，再煉苗5d后移栽至溫室，遮蔭、保持土壤濕潤，溫度控制在（25±1）℃、光照12h／d，空氣濕度90%以上。移栽土壤為營養(yǎng)土、珍珠巖、蛭石，三者的質(zhì)量比為3∶1∶1。土壤事先經(jīng)高溫、高壓滅菌，珍珠巖和蛭石在滅菌前要用自來水沖洗干凈。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將組培苗葉片切成大小為1.0cm×1.0cm的葉盤，接種在不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響見表1所列。由表1可以看出，由組培苗葉片進行愈傷組織的誘導(dǎo)效率比較高，可以達到100%。所產(chǎn)生愈傷組織的不同狀態(tài)取決于所添加的生長素的種類。添加了2，4－D（2，4－二氯苯氧乙酸）的培養(yǎng)基上產(chǎn)生淡黃色或白色、質(zhì)地疏松狀態(tài)的愈傷組織。而IBA（吲哚丁酸）或NAA（萘乙酸）的添加則產(chǎn)生另一種綠色、質(zhì)地致密的愈傷組織，并且還有部分葉盤也可以直接產(chǎn)生不定芽。愈傷組織和不定芽都主要形成于葉柄基部及葉脈處。

在添加2，4－D的培養(yǎng)基中，隨著細胞分裂素ZT（玉米素）和BA（6－芐基腺嘌呤）質(zhì)量濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率都呈現(xiàn)先升后降的趨勢。試驗結(jié)果表明，最有利于疏松狀態(tài)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為 MS＋0.5mg／L ZT＋0.5mg／L 2，4－D，最有利于致密狀態(tài)愈傷組織形成的培養(yǎng)基為 MS＋3.0mg／L BA＋1.0mg／L NAA。

表1 植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2 調(diào)節(jié)劑對愈傷組織不定芽分化的影響

將誘導(dǎo)試驗得到的淡黃色或白色愈傷組織通過MS＋1.0mg／L ZT培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)，使之轉(zhuǎn)綠并變得致密。而經(jīng)誘導(dǎo)試驗得到的綠色、質(zhì)地致密的愈傷組織可直接轉(zhuǎn)入愈傷組織分化不定芽的試驗。選取生長良好并呈綠色致密狀態(tài)的愈傷組織，切成1.0cm×1.0cm的方塊，接種在不同的分化培養(yǎng)基上，可得調(diào)節(jié)劑對不定芽分化的影響見表2所列。

由表2可以看出，在培養(yǎng)基 MS＋5.0mg／L BA＋0.5mg／L NAA上誘導(dǎo)30d的愈傷組織不定芽分化率就可以達到100%，而培養(yǎng)基 MS＋1.0mg／L ZT＋0.3mg／L IAA 上誘導(dǎo)的不定芽分化率在40d才能達到100%，說明紅陽獼猴桃愈傷組織不定芽分化中BA的作用優(yōu)于ZT，這與在闊葉獼猴桃組織培養(yǎng)中所報道的ZT比BA更有利于誘導(dǎo)不定芽的結(jié)果不一致［6］，也表明了獼猴桃不同品種之間存在的基因型差異［7］。同時，在添加ZT的培養(yǎng)基中都出現(xiàn)了愈傷組織局部產(chǎn)生暗紅色的現(xiàn)象，并且在后期這些暗紅色愈傷褐化死亡，這種現(xiàn)象在前人的報道［8－9］中出現(xiàn)不多。試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基 MS＋5.0mg／LBA＋0.5mg／LNAA為愈傷組織不定芽分化的最優(yōu)培養(yǎng)基。

表2 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽分化的影響

2.3 調(diào)節(jié)劑對不定芽生根的影響

愈傷組織不定芽在分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2次后，選取長勢良好、3cm左右的不定芽，接種到不同的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽生根的影響見表3所列。由表3可見，紅陽獼猴桃不定芽的生根效率較低，培養(yǎng)基1／2MS＋1.2mg／L IBA 的誘導(dǎo)生根效率為最高，達到83.3%。大部分外植體基部首先形成少量的愈傷組織，接著再生出不定根。添加BA后，促進了外植體基部愈傷組織的生長和基部的膨大，對誘導(dǎo)生根具有明顯的抑制作用。從誘導(dǎo)不定芽的生根率和平均生根數(shù)2個指標來看，1／2MS＋1.2mg／L IBA為最優(yōu)的不定芽生根培養(yǎng)基。

表3 植物生長調(diào)節(jié)劑對不定芽生根的影響

2.4 移栽成活

生根苗移栽后30d成活率達到90%以上，成活的苗生長良好，葉片顏色均勻，呈鮮綠色。

3 討 論

試驗由紅陽獼猴桃組培苗葉片得到淡黃色或白色、質(zhì)地疏松和綠色、質(zhì)地致密的2類愈傷組織。淡黃色或白色、質(zhì)地疏松的愈傷組織可以在相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代增殖，增殖系數(shù)大，但也會出現(xiàn)部分水漬化現(xiàn)象。試驗表明，由加入了2，4－D的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的淡黃色或白色、質(zhì)地疏松的愈傷組織進行不定芽分化時，必須先在只加細胞分裂素（如 MS＋1.0mg／L ZT）的培養(yǎng)基上，通過1～2次繼代培養(yǎng)，逐漸轉(zhuǎn)綠變致密后，才可以在愈傷組織不定芽分化培養(yǎng)基上（同時添加細胞分裂素和生長素）實現(xiàn)分化生芽。如果直接轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基，愈傷組織會產(chǎn)生大量的不定根而不分化、不定芽。雖然大量不定根的產(chǎn)生也可以使愈傷組織迅速增殖，并且在切除這些不定根后繼續(xù)誘導(dǎo)不定芽分化時可以產(chǎn)生不定芽，但是再生周期明顯增加，不利于快速繁殖。

有報道稱，在不定芽分化前將由添加了2，4－D的培養(yǎng)基誘導(dǎo)出來的疏松的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS＋1.0mg／L ZT的培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d，然后再轉(zhuǎn)接到不定芽分化培養(yǎng)基上，即采用“二次培養(yǎng)”的方法來解除2，4－D對分化的抑制作用［10］。本試驗將2，4－D作為細胞生長素所表現(xiàn)出來的是誘導(dǎo)生根效應(yīng)。在愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化階段，必須用只加入細胞分裂素作為植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基來誘導(dǎo)不定芽才能獲得成功。

2種不同狀態(tài)的愈傷組織都可以最終再生成完整植株。由 MS＋3.0mg／L BA＋1.0mg／L NAA誘導(dǎo)的綠色、質(zhì)地致密的愈傷組織的再生過程更快、效率更高，可以用于工廠化快繁和遺傳轉(zhuǎn)化等方面。由 MS＋0.5mg／L ZT＋0.5mg／L 2，4－D所誘導(dǎo)的淡黃色、質(zhì)地疏松的愈傷組織再生周期較長，但是對于降低一些試驗（例如多倍體誘導(dǎo)試驗）中的嵌合體現(xiàn)象是有利的。

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