羊流產(chǎn)衣原體的分離鑒定及間接免疫熒光法檢測(cè)

趙榮，李兆才，曹小安，周繼章

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

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羊流產(chǎn)衣原體的分離鑒定及間接免疫熒光法檢測(cè)

趙榮，李兆才，曹小安，周繼章*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

對(duì)收集的疑似衣原體感染的羊流產(chǎn)胎兒樣本接種雞胚卵黃囊進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過(guò)PCR-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析)方法鑒定為流產(chǎn)衣原體。將收集到的流產(chǎn)衣原體陽(yáng)性樣本接種Hela229細(xì)胞，應(yīng)用基于流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體的間接免疫熒光法，在Hela229細(xì)胞漿內(nèi)可見(jiàn)呈綠色熒光的衣原體包涵體，進(jìn)一步在病原學(xué)水平上確定發(fā)生在甘肅省肅南縣羊流產(chǎn)的病原為流產(chǎn)衣原體。

流產(chǎn)衣原體；分離鑒定；PCR-RFLP；間接免疫熒光法

流產(chǎn)衣原體(Chlamydiaabortus)是羊地方性流產(chǎn)的病原[1]，也能引起豬、牛等多種動(dòng)物在妊娠晚期發(fā)生流產(chǎn)[2]。主要寄生于牛、羊、豬等多種動(dòng)物生殖道黏膜表面的上皮細(xì)胞，造成生殖道黏膜受損，引發(fā)母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎等，偶爾會(huì)感染妊娠婦女，引起急性感染或流產(chǎn)[3]。在我國(guó)，自20世紀(jì)80年代以來(lái)，豬、羊等動(dòng)物衣原體病[4]在寧夏[5]、青海[6]、陜西[7]等多個(gè)省、市、自治區(qū)均有發(fā)病和大面積流行的報(bào)道[8-9]。有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，部分地區(qū)牧場(chǎng)的衣原體陽(yáng)性率高達(dá)80%，該疫病的發(fā)病情況呈逐年上升的趨勢(shì)，已經(jīng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響我國(guó)畜牧業(yè)的健康發(fā)展[10]。

2014年，甘肅省肅南縣某羊場(chǎng)部分懷孕羊突然在妊娠晚期發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、弱胎現(xiàn)象嚴(yán)重，給羊場(chǎng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)臨床癥狀，初步懷疑為羊衣原體病。為盡快控制疾病的流行，對(duì)病原進(jìn)行了分離鑒定。目前，最常用的動(dòng)物衣原體檢測(cè)方法是間接血凝方法(IHA)。該法操作簡(jiǎn)便，省時(shí)快捷，適用于血清學(xué)調(diào)查，但無(wú)法區(qū)分衣原體屬下面的不同種，而且判定結(jié)果是用肉眼進(jìn)行觀(guān)察，容易出現(xiàn)誤判。為此，本研究通過(guò)病原的分離培養(yǎng)、間接免疫熒光染色等病原學(xué)方法進(jìn)行了確診檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料 4份病料為采集自甘肅省肅南縣的疑似衣原體感染的4只羊流產(chǎn)胎兒肝臟和脾臟；流產(chǎn)衣原體標(biāo)準(zhǔn)株SX5、鸚鵡熱衣原體CpL和反芻動(dòng)物衣原體E58為本實(shí)驗(yàn)室分離保存菌株；SPF雞胚購(gòu)自蘭州市榆中縣種雞場(chǎng)；Hela229細(xì)胞購(gòu)自ATCC，由本實(shí)驗(yàn)室傳代后于液氮中保存；DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自Biological Industries (BI)公司；胰蛋白酶-EDTA溶液購(gòu)自Solarbio公司；放線(xiàn)菌酮購(gòu)自Sigma公司，用PBS溶液配制成濃度為1 mg/mL的儲(chǔ)存液，0.22 μm細(xì)菌濾器過(guò)濾分裝保存；DEAE-dextran購(gòu)自Sigma公司，用PBS溶液配制成濃度為30 mg/mL的儲(chǔ)存液，0.22 μm細(xì)菌濾器過(guò)濾分裝保存；鼠抗流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自KPL公司；Giemsa染液購(gòu)自Solarbio公司；洗滌緩沖液是含0.1% Triton x-100和1 mg/mL BSA的PBS溶液。

1.2 方法

1.2.1 羊流產(chǎn)衣原體的分離 將采集的羊流產(chǎn)胎兒的肝臟和脾臟等研碎后，用適量含卡那霉素(50 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的生理鹽水稀釋?zhuān)? ℃放置4 h，再以2000 r/min離心30 min，取上清，接種于7日齡雞胚卵黃囊中。棄去接種后3 d內(nèi)死亡的雞胚，收集4～9 d死亡雞胚的卵黃囊膜，連續(xù)傳代。若初次接種分離時(shí)，未致死雞胚再盲傳3～4代直至雞胚有規(guī)律死亡。提取收集的卵黃囊膜所有DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，陽(yáng)性培養(yǎng)物于-80 ℃保存，進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

1.2.2 PCR檢測(cè) 為鑒定樣本是否為衣原體感染，以收集的4～9 d死亡雞胚的卵黃囊膜基因組為模板，根據(jù)GenBank公布的流產(chǎn)衣原體helicase gene clone 8的核苷酸序列，設(shè)計(jì)針對(duì)流產(chǎn)衣原體helicase gene clone 8的引物，以樣本基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物：5’-TGGTATTCTTGCCGAC-3’；下游引物：5’-GATCGTAACTGCTTAATAAACCG-3’。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀(guān)察目的片段的大小[11-12]。同時(shí)將流產(chǎn)衣原體標(biāo)準(zhǔn)株SX5、鸚鵡熱衣原體CpL和反芻動(dòng)物衣原體E58，一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP) 將helicase gene clone 8 基因的PCR擴(kuò)增片段用限制性?xún)?nèi)切酶Alu I消化，20 μL消化液中含PCR產(chǎn)物10 μL、滅菌去離子水7 μL、10×buffer 2 μL、AluI 1 μL，混勻后置37 ℃過(guò)夜，65 ℃或80 ℃ 20 min將酶滅活，消化產(chǎn)物用含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)[11-12]。

1.2.4 流產(chǎn)衣原體的細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法于96孔板中培養(yǎng)Hela229細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后，以含30 μg/mL DEAE-dextran的DMEM培養(yǎng)液預(yù)處理10 min，接種適量衣原體陽(yáng)性的雞胚卵黃囊膜懸液，每孔100 μL，3000 r/min離心60 min，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)放置2 h，棄掉接種液，每孔加入200 μL含10% FBS和0.5 μg/mL放線(xiàn)菌酮的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后觀(guān)察結(jié)果。

1.2.5 流產(chǎn)衣原體包涵體的Giemsa染色檢測(cè) 樣本接種細(xì)胞48～72 h進(jìn)行Giemsa染色檢測(cè)衣原體包涵體，具體操作步驟如下：吸出細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)的衣原體生長(zhǎng)培養(yǎng)液，用無(wú)水甲醇固定單層細(xì)胞10 min，空氣中充分揮發(fā)，加Giemsa染液染色30 min，用95%乙醇快速洗滌1次或PBS洗滌3次，干后鏡檢。

1.2.6 流產(chǎn)衣原體包涵體的間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞于接種48～72 h后，吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌2次，-20 ℃無(wú)水甲醇固定單層細(xì)胞10 min[13]，預(yù)冷洗滌緩沖液(Washing Buffer, WB)振蕩洗滌3次，每次3 min；加入鼠抗流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體100 μL(用10% FBS 50倍稀釋)，4 ℃過(guò)夜孵育，預(yù)冷WB振蕩洗滌3次，每次3 min；加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體100 μL(用10% FBS 100倍稀釋)，37 ℃避光孵育45 min，用預(yù)冷WB振蕩洗滌5次，每次3 min；DAPI染色5～10 min，然后用預(yù)冷PBS振蕩洗滌3次，每次3 min；最后在熒光顯微鏡下觀(guān)察，并拍照。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果 依據(jù)設(shè)計(jì)的引物，對(duì)4份樣本進(jìn)行了擴(kuò)增，其中3份均獲得約479 bp的單一目的片段，一份為陰性，與預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)值相符，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

1,9: DNA Ladder 100; 2:C.abortus SX5; 3:C.psittaci CPL; 4:C.pecorum E58; 5,6,8:陽(yáng)性樣本；7:陰性樣本圖1 helicase gene clone 8基因的PCR結(jié)果

2.2 RFLP結(jié)果 通過(guò)對(duì)helicase gene clone 8 基因的PCR擴(kuò)增片段用限制性?xún)?nèi)切酶AluI消化，得到了如圖2所示的結(jié)果。

2.3 Giemsa染色檢測(cè)結(jié)果 普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，在感染的Hela229細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)橢圓形或帽狀的衣原體包涵體，胞漿淡染，包涵體呈藍(lán)紫色(圖3箭頭所示)。

2.4 間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence，IIF)檢測(cè)結(jié)果 將接種流產(chǎn)衣原體分離株48～72 h的Hela229細(xì)胞固定后，以抗流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體進(jìn)行熒光染色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察，在感染的Hela229細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)色的細(xì)胞核旁呈綠色橢圓形或帽狀的流產(chǎn)衣原體包涵體(圖4)。

3 討論與小結(jié)

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)衣原體種特異性引物helicase gene clone 8的引物，對(duì)樣本基因組進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。雖然反芻動(dòng)物衣原體也可引起羊流產(chǎn)，但是PCR未能擴(kuò)增出E58菌株helicase gene clone 8基因，說(shuō)明造成甘肅肅南縣羊的衣原體性流產(chǎn)不是由反芻動(dòng)物衣原體引起的。對(duì)于流產(chǎn)衣原體和鸚鵡熱衣原體的區(qū)分早有報(bào)道[12,14]，本研究對(duì)helicase gene clone 8基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)AluI消化后進(jìn)一步RFLP分析，鸚鵡熱衣原體CpL helicase gene clone 8片段未被切開(kāi)，仍為479 bp，而陽(yáng)性樣本的helicase gene clone 8基因則被切為兩個(gè)片段，這與流產(chǎn)衣原體標(biāo)準(zhǔn)株SX5的特征一致，說(shuō)明本次羊流產(chǎn)是由流產(chǎn)衣原體導(dǎo)致的。

為了從病原學(xué)上進(jìn)一步的鑒定，本研究在Hela229細(xì)胞上對(duì)分離到的衣原體進(jìn)行了培養(yǎng)。分別采用Giemsa染色法和基于流產(chǎn)衣原體MOMP單克隆抗體的間接免疫熒光法對(duì)流產(chǎn)衣原體包涵體進(jìn)行檢測(cè)，從Giemsa染色情況來(lái)看，可以觀(guān)察到有衣原體的包涵體形成，但無(wú)法確定為流產(chǎn)衣原體。通過(guò)進(jìn)一步的間接免疫熒光觀(guān)察，Hela229細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)藍(lán)色的細(xì)胞核旁呈綠色橢圓形或帽狀的衣原體包涵體，這從病原學(xué)上再次證明，本次羊流產(chǎn)是由流產(chǎn)衣原體引起的。間接免疫熒光法在人沙眼衣原體的分離鑒定上，素有“金標(biāo)準(zhǔn)”之稱(chēng)，但是對(duì)于動(dòng)物衣原體病原學(xué)診斷方面除PCR之外，在細(xì)胞培養(yǎng)上還未建立起好的診斷方法，因此，本研究所建立的間接免疫熒光診斷技術(shù)不僅為將來(lái)建立動(dòng)物衣原體細(xì)胞感染診斷奠定基礎(chǔ)，也為將來(lái)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得流產(chǎn)衣原體感染滴度、制備動(dòng)物衣原體滅活疫苗奠定前期的科學(xué)基礎(chǔ)。

總之，本研究通過(guò)對(duì)肅南縣羊流產(chǎn)物雞胚分離，通過(guò)PCR-RFLP鑒定、Giemsa染色以及間接免疫熒光檢測(cè)，確定該地區(qū)的羊流產(chǎn)為流產(chǎn)衣原體所導(dǎo)致，這為藥物治療及疫苗防控提供了科學(xué)依據(jù)。

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(編輯：李文平)

Isolation and Identification of OvineChlamydiaabortusand Detection with Indirect Immunofluorescence

ZHAO Rong, LI Zhao-cai, CAO Xiao-an, ZHOU Ji-zhang*

(StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResarchInstitute,ChineseAcedemyofAgriculturalSciences,Lanzhou730046,China)

The sample was collected from the suspectedChlamydiaabortus(C.abortus) infected fetal, which was inoculated into the SPF embryonated chicken eggs.It was identified asC.abortusby PCR-RFLP method.The sample which was PCR-RFLP positive was inoculated on Hela229 cell and then the whole cell inclusions ofC.abortuswere detected by indirect immunofluorescence assay (IIF) based on anti-C.abortusMOMP monoclonal antibody.Chlamydial inclusion of green fluorescence could be seen in the cytoplasm of Hela229 cells by IIF.It indicated on etiology level that the abortion in sheep in Sunan country was caused byChlamydiaabortus.

Chlamydiaabortus; isolation and identification; PCR-RFLP; indirect immunofluorescence

趙榮，碩士研究生，從事動(dòng)物疫苗與分子免疫研究。

周繼章。E-mail:zhoujizhang@126.com

2015-08-25

A

1002-1280 (2015) 11-0021-04

S852.67