豬霍亂沙門菌裂解性噬菌體的分離鑒定及生物學特性研究

蔣依倩，齊宇，徐鳳宇

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118)

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豬霍亂沙門菌裂解性噬菌體的分離鑒定及生物學特性研究

蔣依倩，齊宇，徐鳳宇*

(吉林農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，長春 130118)

以藥敏試驗篩選出的多重耐藥豬霍亂沙門菌為宿主，經(jīng)雙層瓊脂純化法從健康豬糞便中獲得裂解性噬菌體SP3383。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該噬菌體為長尾病毒科成員；酶切分析表明其基因組為大于47.4 kb的雙鏈DNA，可被限制性內(nèi)切酶NcoI和BamH I酶切；生物學特性研究表明SP3383對溫度和酸堿環(huán)境耐受力較好;最佳感染復數(shù)為0.1，潛伏期約為30 min，爆發(fā)期約60 min，平均爆發(fā)量為48 PFU/cell。本研究可為應用噬菌體治療耐藥豬霍亂沙門菌感染提供參考。

豬霍亂沙門菌；裂解性噬菌體；生物學特性

豬沙門菌病是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一，主要由豬霍亂沙門菌、豬傷寒沙門菌、腸炎沙門菌等病原菌引起[1]。近年來，沙門菌的耐藥性日益增強[2]，具有多重耐藥的豬霍亂沙門菌在世界各地陸續(xù)被報道[3-5]。如何有效防控耐藥沙門菌株感染，成為困擾養(yǎng)殖戶的難題。噬菌體作為細菌的“天敵”，已被各國學者作為治療多重耐藥菌感染的新希望，也是當前的研究熱點[6]。大量動物實驗結(jié)果表明，噬菌體能有效治療細菌感染，其與抗生素相比有很大優(yōu)勢：依賴宿主菌進行復制，治療所需劑量小；專一性強，對機體正常菌群副作用小[7]。本研究選取對多種抗生素耐藥的豬霍亂沙門菌為宿主，分離裂解性沙門菌噬菌體，通過研究其基本生物學特性，在豐富對噬菌體多樣性認知的同時，也為更深入地研究和利用該噬菌體奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬霍亂沙門菌CVCC3383株、CVCC3775株、CVCC3780株、TTBSS株、大腸桿菌ATCC25922株；本實驗室分離并保存的沙門菌JL-1株、JL-2株、JL-3株、GZL-3株、SY-11株、CF-1株、CF-2株、金黃色葡萄球菌LY株、大腸桿菌SHY株、TH株。

1.2 主要試劑與儀器 聚乙二醇、DNase I、RNase A、Mung Bean Nuclease酶購自北京鼎國生物技術有限責任公司；限制性內(nèi)切酶購自大連寶生生物工程有限公司；阿莫西林、恩諾沙星、鏈霉素等7種藥敏片購自杭州微生物公司；LB培養(yǎng)液、上層LB培養(yǎng)基(含0.7%瓊脂)、下層LB培養(yǎng)基(含1.5%瓊脂)、2×LB培養(yǎng)液(酵母粉10 g，胰蛋白胨20 g，NaCl 20 g，定容至1L)依標準方法配制；水解酪蛋白瓊脂(MH瓊脂)購自海博生物技術有限公司。Himac CP100MX超速離心機為日本日立公司產(chǎn)品；TEM-100CX透射電鏡為日本TEOL LTD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌的篩選 分別用無菌生理鹽水稀釋豬霍亂沙門菌CVCC3383株、CVCC3780株、CVCC3775株、TTBSS株過夜培養(yǎng)菌液，使菌液濃度為108CFU/mL。將菌液均勻地涂布于直徑9 cm的MH平板上，室溫下放置5 min后，將阿莫西林、恩諾沙星、鏈霉素等7種藥敏片貼于培養(yǎng)基表面并做好標記，將平板置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～18 h后觀察結(jié)果，根據(jù)CLSI動物源細菌藥敏試驗標準以及人醫(yī)CLSI細菌藥敏試驗標準[8-9]判斷細菌耐藥情況。以大腸桿菌ATCC25922株進行質(zhì)量控制。

1.3.2 噬菌體的分離與純化 以篩選出的耐藥沙門菌作為宿主菌分離噬菌體。采集不同豬場的新鮮糞樣用生理鹽水重懸后靜置1 h，上清液7000 r/min離心20 min，收集上清用0.22 μm微孔濾器過濾。取濾液5 mL加入5 mL 2×LB培養(yǎng)液，再加入200 μL過夜培養(yǎng)宿主菌，室溫靜置 15 min，37 ℃、150 r/min 振蕩過夜進行噬菌體富集培養(yǎng)。將培養(yǎng)液4 ℃、12000 r/min離心20 min，取上清重復富集操作3次，用0.22 μm濾膜過濾得擬含噬菌體的原液。通過點滴法進行驗證實驗：用涂布棒將100 μL過夜培養(yǎng)的宿主菌(菌液濃度達1.0×109CFU/mL)于直徑7 cm的LB平板上涂開，滴加噬菌體原液5μL，陰性對照組(CK)滴加等量LB培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)12 h觀察菌苔形成情況，滴加噬菌體原液后形成無菌區(qū)域即噬菌體分離成功。

利用雙層平板法進行噬菌體的純化：取適當稀釋倍數(shù)的噬菌體原液100 μL與100 μL菌液混合，室溫放置15 min，加入50 ℃上層培養(yǎng)基5 mL，迅速混勻，傾倒入下層LB平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，觀察噬菌斑。挑取大且透亮的單一噬斑于5 mL LB培養(yǎng)液中，加入100 μL宿主菌培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液4 ℃ 12000 r/min離心20 min，取上清檢測噬菌斑形成情況。此過程重復多次，即得純化噬菌體。

1.3.3 噬菌體的濃縮與電鏡觀察 純化后的噬菌體按照λ噬菌體顆粒的PEG/NaCl沉淀提取方法[8]進行濃縮，得到噬菌體濃縮液。采用磷鎢酸負染法，在透射電鏡下觀察噬菌體的形態(tài)。

1.3.4 噬菌體核酸類型鑒定與酶切分析 參照《分子克隆實驗指南》中從大規(guī)模培養(yǎng)物中提取λ噬菌體基因組的方法[8]得到噬菌體核酸。分別將DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease與噬菌體核酸混合，37 ℃溫育1 h，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測其結(jié)果。分別用限制性內(nèi)切酶BInI、EcoR I、BamH I、NcoI和Xhol I將噬菌體核酸37 ℃酶切10 h，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

1.3.5 噬菌體的宿主譜分析 通過點滴法分析噬菌體的噬菌譜：將除宿主菌外的12株受試菌株(108CFU/mL)菌液均勻地涂布于培養(yǎng)基上，室溫放置5 min后，滴加5 μL純化后的噬菌體液，待吸收后恒溫培養(yǎng)過夜，觀察細菌和噬菌體的生長情況。統(tǒng)計各細菌的裂解情況即得該噬菌體的宿主譜。

1.3.6 噬菌體的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性測定 取200 μL噬菌體分別與等體積不同pH值的LB培養(yǎng)液(pH值2～13)混勻，37 ℃水浴2 h，利用雙層平板法測定效價。取200 μL噬菌體(9×108PFU/mL)分別于 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃水浴環(huán)境中作用20、40、60 min，測定其效價變化。

1.3.7 噬菌體最佳感染復數(shù)(MOI)的測定 取對數(shù)期宿主菌，按感染復數(shù)分別為1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001加入噬菌體和宿主菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)5 h，4 ℃ 12000 r/min離心20 min，取上清液測定各組噬菌體效價。

1.3.8 噬菌體的一步生長曲線 取對數(shù)期宿主菌，按測得的MOI值加入噬菌體，37 ℃溫育20 min，10000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀用LB培養(yǎng)液洗滌兩次后加入37 ℃預熱的LB培養(yǎng)液中混勻，迅速于37 ℃振蕩培養(yǎng)，于0時刻和每隔10 min取樣，測定噬菌體效價。以感染時間為橫坐標，噬菌體效價對數(shù)值為縱坐標，繪制一步生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 宿主菌的篩選 藥敏試驗結(jié)果表明，大腸桿菌ATCC25922株的抑菌圈在預期范圍內(nèi)，4株豬霍亂沙門菌中，CVCC3383株沙門菌僅對頭孢噻肟敏感，對阿莫西林、恩諾沙星、鏈霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、多西環(huán)素不敏感(圖1)，選作宿主菌。

1.阿莫西林；2.恩諾沙星；3.鏈霉素；4.氟苯尼考；5.環(huán)丙沙星；6.頭孢噻肟；7.多西環(huán)素圖1 CVCC3383株沙門菌藥敏實驗結(jié)果

2.2 噬菌體的分離純化 點滴法驗證結(jié)果見圖2，LB平板上滴加擬含噬菌體的原液后出現(xiàn)CVCC3383沙門菌的無菌區(qū)域，陰性對照正常長出菌苔，說明噬菌體分離成功。通過反復純化，得到純化后的噬菌體，雙層平板噬斑結(jié)果見圖3。純化后的噬菌體噬斑透亮，邊緣整齊，直徑約1.5～1.8 mm(培養(yǎng)12 h)，將其命名為SP3383。

CK:滴加LB培養(yǎng)液作陰性對照；SP3383:滴加擬含噬菌體的原液后形成的無菌區(qū)圖2 噬菌體原液點滴法驗證實驗

圖3 噬菌體純化結(jié)果

2.3 噬菌體的電鏡觀察 透射電鏡觀察SP3383呈蝌蚪狀，頭長(41.40±0.33)nm，寬(43.86±0.26)nm，尾長(96.49±0.38)nm，屬于有尾噬菌體目，長尾病毒科(圖4)。

圖4 噬菌體SP3383的透射電鏡觀察圖

2.4 噬菌體的核酸類型鑒定與酶切分析 提取噬菌體SP3383基因組，分別用DNase I、RNase A、Mung Bean Nuclease作用后進行電泳檢測，發(fā)現(xiàn)SP3383核酸能被DNase I完全降解，證實SP3383為雙股DNA噬菌體(圖5)。用限制性內(nèi)切酶BInI、EcoR I、BamH I、NcoI、XholI對SP3383的核酸進行酶切，經(jīng)電泳檢測發(fā)現(xiàn)，SP3383含有BamH I、NcoI的酶切位點，經(jīng)NcoI酶切后可獲得清晰的5條帶，通過與Maker比較經(jīng)計算可知噬菌體SP3383基因組長度大于47.4 kb(圖6)。

M1、M2：λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；1.SP2基因組；2.DNase I作用結(jié)果；3.RNase A作用結(jié)果；4.Mung Bean Nuclease作用結(jié)果圖5 噬菌體SP3383核酸類型鑒定結(jié)果

M：λ-Hind Ⅲ digest DNA Marker；1.BIn I酶切；2.EcoR I酶切；3.BamH I酶切；4.Nco I酶切；5.Xhol I酶切圖6 噬菌體SP3383基因組DNA酶切圖

2.5 噬菌體的宿主譜分析 點滴法測定SP3383的宿主范圍，除裂解豬霍亂沙門菌CVCC3383外，還能裂解CVCC3775株霍亂沙門菌、CVCC3780株霍亂沙門菌。

2.6 噬菌體的熱穩(wěn)定性與酸堿穩(wěn)定性 噬菌體SP3383在pH值為4～11的條件下具有較高的效價。雖然pH值小于6及大于9都會導致噬菌體效價降低，但仍能達到108PFU/mL。SP3383在強酸或強堿環(huán)境下(pH≤3或pH≥12時)喪失活性(圖7)。

圖7 噬菌體SP3383的酸堿穩(wěn)定性

溫度對噬菌體SP3383的影響見圖8，從中可以看出噬菌體在40～65 ℃下作用20、40、60 min效價變化不明顯，幾乎維持在初始效價。當環(huán)境溫度達到70 ℃時，作用時間越長噬菌體效價降低約明顯，75 ℃作用60 min后幾乎不存在活性噬菌體。而在80 ℃的高溫處理條件下噬菌體基本被滅活。

圖8 噬菌體SP3383的熱穩(wěn)定性

2.7 噬菌體的最佳感染復數(shù) 結(jié)果見表1。當感染復數(shù)為0.1時噬菌體SP3383效價為1.54×1010PFU/mL，在7個感染復數(shù)中最高，為最佳感染復數(shù)。

表1 噬菌體SP3383的MOI測定結(jié)果

2.8 噬菌體的一步生長曲線 繪制噬菌體SP3383的一步生長曲線如圖9所示，SP3383感染宿主菌后30 min內(nèi)，噬菌體的量基本不變，即潛伏期約30 min；在感染后的30～90 min內(nèi)，噬菌體的量急速增加，因而該噬菌體的爆發(fā)期約60 min；在隨后的60 min，噬菌體的量變化不大，即噬菌體進入到穩(wěn)定期；根據(jù)公式爆發(fā)量=爆發(fā)末期噬菌體效價/感染初期宿主菌濃度，算得SP3383爆發(fā)量約為48 PFU/cell。

圖9 噬菌體SP3383一步生長曲線

3 討論

目前，細菌耐藥問題日益凸顯，已成為世界關注的焦點。而近年來的耐藥檢測結(jié)果表明沙門菌耐藥情況也越來越嚴重，加春生等[9]對25株豬霍亂沙門菌臨床分離株進行了18種臨床常用抗生素的藥敏試驗，結(jié)果表明它們對氨芐青霉素、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和氨基糖苷類藥物高度耐藥。本研究經(jīng)藥敏試驗篩選出多重耐藥沙門菌作為宿主分離到裂解性噬菌體SP3383，為防控耐藥沙門菌提供了新思路。

為了更合理地應用噬菌體SP3383，本研究對其進行了生物學特性分析。結(jié)果表明：SP3383對酸堿的耐受能力明顯優(yōu)于李萌等[10]報道的沙門菌噬菌體SP3和Ahiwale 等[11]報道的噬菌體φSPB，與包紅朵等[12]報道的噬菌體PA13076、PC2184和江艷華等[13]報道的SLMP1相近；SP3383較噬菌體SP3、φSPB、PA13076、PC2184以及SLMP1耐受的溫度更高；SP3383與噬菌體SP3、PA13076相比，潛伏期長，爆發(fā)持續(xù)時間短，爆發(fā)量高，說明其具有良好的裂解能力。

一般而言，噬菌體侵入的宿主非常特異，這與其吸附的特異受體有關，也與細菌演化的免疫機制有關[14]。毛普加等[15]通過試驗確定了長尾副甲噬菌體受體為副甲菌的脂多糖和外膜蛋白，而噬菌體SP3383的受體是否與此相同，需要進一步深入研究。

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(編輯：李文平)

Isolation, Identification and Biological Characteristics Study of LyticSalmonellacholeraesuisBacteriophage

JIANG Yi-qian, QI Yu, XU Feng-yu*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China)

This research used the multiple drug-resistantSalmonellacholeraesuisstrain which was screened out through the drug sensitive test as the host, and isolated the lytic bacteriophage SP3383 from the health pig’s feces by double agar purification method.The electron microscopic observations found that SP3383 belonged toSiphoviridae, and the enzyme digestion analysis indicated that its genome was double stranded DNA whose length was greater than 47.4kb and the genomes could be digested by restriction enzymesNcoI andBamH I.The results of biological characteristics studies showed that SP3383 had excellent tolerance to temperature, acidic or alkaline environment, the optimal MOI was 0.1, the latent period was 30 min, the burst period was 60 min and the average burst size was about 48 PFU per cell.This research can provide reference for the application of bacteriophage to treat the infection of multi-drug resistanceSalmonellacholeraesuis.

Salmonellacholeraesuis; lytic bacteriophage; biological characteristics

吉林省科技廳項目(20140204069NY)

蔣依倩，碩士研究生，從事動物微生態(tài)制劑研究。

徐鳳宇。E-mail: Xvfengyv2002@126.com

2015-08-07

A

1002-1280 (2015) 11-0005-06

S852.6