同工酶分析法鑒定ST細(xì)胞系的研究

張敏，陳小云，蔣桃珍，王棟，王磊，王靜文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

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同工酶分析法鑒定ST細(xì)胞系的研究

張敏，陳小云，蔣桃珍，王棟，王磊，王靜文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為鑒定ST細(xì)胞系的種屬和純凈性，選用乳酸脫氫酶(LD)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和核苷酸磷酸脫氫酶(NP)三種同工酶對(duì)ST細(xì)胞系進(jìn)行了同工酶鑒定分析。結(jié)果顯示：ST細(xì)胞系與豬睪丸原代細(xì)胞的三種同工酶譜帶一致，不存在別的雜帶，表明該ST細(xì)胞系與豬睪丸原代細(xì)胞同種，且不存在其他細(xì)胞的交叉污染。本研究可為其他動(dòng)物源細(xì)胞的種屬鑒定和交叉污染檢測(cè)提供借鑒。

ST細(xì)胞系；同工酶；種屬鑒定；交叉污染

同工酶是具有同一催化作用，但組成、結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一組酶，廣泛地存在于高等生物細(xì)胞內(nèi)。同工酶是基因編碼的產(chǎn)物，能較好地反映物種間的遺傳差異，常被用于物種的分類、鑒定和親緣關(guān)系研究[1]。不同種屬來(lái)源的細(xì)胞具有不同的同工酶分布，通過(guò)電泳分離可得到它們特異性的同工酶圖譜，因此同工酶檢測(cè)可作為種屬鑒別的依據(jù)。20世紀(jì)60年代，人們即開(kāi)始將同工酶分析法用于動(dòng)物細(xì)胞種屬的鑒別[2-4],由于當(dāng)時(shí)只選用1～2種同工酶，這些同工酶圖譜在某些種屬關(guān)系親近的動(dòng)物細(xì)胞之間差異小，不好區(qū)分，而且細(xì)胞種屬鑒定一直未引起人們足夠的重視，使此方法未能廣泛被采用。后經(jīng)反復(fù)比較求證，證實(shí)在動(dòng)物細(xì)胞鑒定上，選用乳酸脫氫酶(LD)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和核苷酸磷酸脫氫酶(NP)這三種同工酶即可將動(dòng)物細(xì)胞完全鑒定區(qū)分開(kāi)[5]。

ST細(xì)胞系是豬瘟病毒等豬源病毒的敏感細(xì)胞，常用于豬源病毒的分離培養(yǎng)和體外增殖，近年來(lái)被用作豬瘟等疫苗的生產(chǎn)基質(zhì)發(fā)揮了重要作用，其株系特征及純凈性越來(lái)越受到人們的重視，但用同工酶分析法鑒定ST細(xì)胞的種屬及純凈性還未見(jiàn)報(bào)道。本文選用乳酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和核苷酸磷酸脫氫酶三種同工酶，在借鑒其他細(xì)胞同工酶分析方法的基礎(chǔ)上，摸索實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)CVCC細(xì)胞庫(kù)保存的ST細(xì)胞系進(jìn)行了同工酶分析鑒定研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞株：豬睪丸原代細(xì)胞，從1日齡健康仔豬體內(nèi)分離豬睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)室自制；內(nèi)參對(duì)照細(xì)胞株：小鼠成纖維細(xì)胞系(L929)、人宮頸癌細(xì)胞系(Hela)，均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；樣品細(xì)胞：傳代豬睪丸ST細(xì)胞系，國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心(CVCC)細(xì)胞庫(kù)保存。

1.1.2 溶液 細(xì)胞裂解液：Tris 0.303 g，EDTA 0.0186 g,質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%TritonX-100 50 μL，加水定容至50 mL，HCl調(diào)pH至7.5，4 ℃保存。巴比妥緩沖液：巴比妥鈉10.3 g，巴比妥1.84 g，加水定容至1000 mL，4 ℃保存。LD顯色底物：NAD 5 mg，MTT 2 mg，PMS 0.4 mg，1 mol/L乳酸鈉1 mL，0.1 mol/L NaCl 0.5 mL，0.5 mol/L的Tris-Cl(pH8.0)1.5 mL，加水定容至10 mL。G6PD顯色底物：NADP 3 mg，MTT 2 mg，PMS 0.4 mg，G6PD 50 mg，MgCl210 mg,0.5 mol/L的Tris-Cl(pH 8.0)2 mL，加水定容至10 mL。NP顯色底物：肌苷20 mg，MTT 2 mg，PMS 0.4 mg，黃嘌呤氧化酶0.3 unit，0.1 mol/L Na2HPO41 mL，0.5 mol/L Tris-HCl(pH7.5)1 mL，加水定容至10 mL。瓊脂糖凝膠：瓊脂糖0.8 g，EDTA 0.035 g，巴比妥緩沖液100 mL加熱溶化。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞同工酶的提取[6]將豬腎原代細(xì)胞、L929、Hela、ST細(xì)胞系在T-25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至鋪滿瓶底時(shí)，吸出培養(yǎng)基。PBS洗細(xì)胞單層，加1 mL胰酶置37℃溫箱消化，待細(xì)胞脫壁，加2 mL含10%小牛血清的MEM培養(yǎng)基中和胰酶的作用，并將其轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管，1000 r/min，離心10 min，棄去上清，加1 mL PBS液吹打均勻，快速離心，吸干殘留PBS。估算細(xì)胞的體積，加等體積的細(xì)胞裂解液置室溫反應(yīng)2～3 min，冰上反應(yīng)30 min，4 ℃ 12000 r/min離心5 min，吸出上清移至新的EP管，-20 ℃保存。

1.2.2 瓊脂糖凝膠制備 根據(jù)李岑[7]的方法，將2片0.175 mm厚的市售透明膠片夾在兩塊膠槽中間，用文件夾將膠槽和膠片固定在一起。將瓊脂糖凝膠用注射器緩緩從膠槽上的小孔注入膠槽與膠片之間，注入凝膠時(shí)注意避免氣泡的產(chǎn)生，并使凝膠均勻的分布在膠片上，待凝固后放4 ℃預(yù)冷后使用。

1.2.3 電泳 小心將凝膠剝離膠板，將載有凝膠的膠片放入電泳槽內(nèi)，然后將細(xì)胞裂解上清液用移液槍加到點(diǎn)樣孔中，每孔上樣1～3 μL，靜置30 s使樣品完全被凝膠吸收后，注入電泳液，LD電泳電壓為95 V，電泳時(shí)間為1.5 h，G6PD電泳電壓為90 V，電泳時(shí)間為1 h，NP電泳電壓為85 V，電泳時(shí)間為1 h。為保證同工酶的活性，電泳過(guò)程均在冰浴上進(jìn)行。

1.2.4 顯色 停止電泳后，取出凝膠膠片，放置在暗盒內(nèi)，注入3～5 mL對(duì)應(yīng)底物的顯色液，37 ℃反應(yīng)20～25 min，酶譜出現(xiàn)后，在清水中清洗膠片2～3次，用濾紙吸去膠片上的殘留水分即可拍照。

1.2.5 結(jié)果判定 顯色后，內(nèi)參細(xì)胞Hela和L929同工酶譜帶與已發(fā)表文獻(xiàn)一致，說(shuō)明電泳條件成立。樣品細(xì)胞與標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞三種同工酶條帶數(shù)目均相同，且每一條帶中心位置與上樣孔距離(遷移距離)相同，說(shuō)明為同一種屬細(xì)胞，若無(wú)其他雜帶，說(shuō)明細(xì)胞無(wú)交叉污染。

2 結(jié)果

2.1 乳酸脫氫酶(LD)同工酶電泳試驗(yàn) 結(jié)果如圖1所示。可以看出，Hela細(xì)胞的LD同工酶譜條帶數(shù)有5條，第一條譜帶在孔的下方，其他四條在孔的上方，L929譜帶有3條，均在孔上方，這與文獻(xiàn)[6]一致，說(shuō)明電泳條件成立。ST細(xì)胞系、豬睪丸原代細(xì)胞的LD同工酶譜條帶數(shù)也為5條，從遷移距離上看，ST細(xì)胞系和豬睪丸原代細(xì)胞的5條譜帶均在孔的上方，遷移距離完全一致，且不存在別的雜帶。

1.Hela細(xì)胞； 2.L929細(xì)胞； 3.豬睪丸原代細(xì)胞; 4.ST細(xì)胞系圖1 LD同工酶電泳圖

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)同工酶電泳試驗(yàn) 結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯?，四種細(xì)胞的G6PD同工酶譜條帶數(shù)均為一條，但遷移距離卻存在明顯區(qū)別，ST細(xì)胞系譜帶的遷移距離與豬睪丸原代細(xì)胞的距離一致，且不存在別的雜帶。

1.Hela細(xì)胞； 2.L929細(xì)胞； 3.豬睪丸原代細(xì)胞; 4.ST細(xì)胞系圖2 G6PD同工酶電泳圖

2.3 核苷酸磷酸脫氫酶(NP)同工酶電泳試驗(yàn) 結(jié)果如圖3所示。可以看出，四種細(xì)胞的NP同工酶譜條帶數(shù)均為一條，但遷移距離卻存在明顯區(qū)別，ST細(xì)胞系譜帶的遷移距離與豬睪丸原代細(xì)胞的距離一致，且不存在別的雜帶。

1.Hela細(xì)胞； 2.L929細(xì)胞； 3.豬睪丸原代細(xì)胞; 4.ST細(xì)胞系圖3 NP同工酶電泳圖

上述三項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，ST細(xì)胞系與豬睪丸原代細(xì)胞的三種同工酶譜帶完全相同，且條帶中不存在別的雜帶，而與Hela細(xì)胞和L929細(xì)胞的譜帶存在顯著差異。因此，該ST細(xì)胞系應(yīng)與豬睪丸原代細(xì)胞同種，且不存在其他細(xì)胞的交叉污染。

3 討論與小結(jié)

作為生物學(xué)研究與生產(chǎn)的重要原材料，細(xì)胞系的株系特性、種屬來(lái)源、是否交叉污染等，不僅直接影響到科研數(shù)據(jù)的可靠性和真實(shí)性，更關(guān)系到生產(chǎn)產(chǎn)品的質(zhì)量。據(jù)分析，每年約有15%～25%的研究論文因?yàn)槭褂昧吮诲e(cuò)誤辨識(shí)和交叉污染的細(xì)胞而獲得錯(cuò)誤的結(jié)論，由此導(dǎo)致數(shù)以百萬(wàn)美元研究經(jīng)費(fèi)的浪費(fèi)?！稓W洲藥典》[8]和《中國(guó)藥典》[9](2010年版)中已經(jīng)規(guī)定細(xì)胞鑒別試驗(yàn)是必須進(jìn)行的一項(xiàng)檢驗(yàn)，而我國(guó)獸用生物制品行業(yè)對(duì)細(xì)胞系的純凈性鑒定尚未引起足夠重視。目前國(guó)際上對(duì)動(dòng)物細(xì)胞系身份識(shí)別、交叉污染的主要檢測(cè)方法之一是同工酶檢測(cè)法，該方法靈敏度較高、結(jié)果可靠、時(shí)間短，而且只需很少的樣品量即可檢測(cè)。

同工酶譜目前還沒(méi)有商品化的分子Marker，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們需要找到一種同源標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株，既可以選用種屬背景清楚的商品細(xì)胞株，也可直接選用原代細(xì)胞株。本文選用與ST細(xì)胞同源的豬原代睪丸細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)參考細(xì)胞株，同時(shí)用Hela細(xì)胞和L929細(xì)胞作為內(nèi)參對(duì)照細(xì)胞。

由于同工酶試驗(yàn)受酶含量、酶活性、電流、電壓、電泳時(shí)間、試劑批次、染色的時(shí)間影響很大，經(jīng)常不同批次的試劑就需要重新摸索試驗(yàn)條件，因此前期試驗(yàn)條件的摸索需要耗費(fèi)較長(zhǎng)時(shí)間。本試驗(yàn)對(duì)提取同工酶的細(xì)胞量進(jìn)行了反復(fù)試驗(yàn)，細(xì)胞數(shù)太少，所提酶含量就低，電泳顯色后，色帶顏色太淺或無(wú)色帶，無(wú)法進(jìn)行結(jié)果判斷，反之，酶的量太高，色帶太寬或形成空泡樣，影響結(jié)果的判斷。經(jīng)摸索，LD和NP同工酶細(xì)胞數(shù)量在106～107/mL左右時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果最佳；而G6PD同工酶細(xì)胞數(shù)需達(dá)到109/mL才能看見(jiàn)明顯條帶,這與陳麗婷[6]、姜典才[10]的結(jié)果相同。其次，本試驗(yàn)對(duì)電泳時(shí)間和電壓進(jìn)行了摸索，電泳時(shí)間過(guò)短或電壓過(guò)低，條帶分離不完全，電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或電壓過(guò)高，色帶過(guò)于分散，而且產(chǎn)熱多也易使不穩(wěn)定的同工酶失活造成沒(méi)有顯帶。我們采用在冰浴中電泳，從而降低電泳過(guò)程中溫度，保護(hù)了同工酶的活性。

本研究利用三種同工酶成功地對(duì)CVCC細(xì)胞庫(kù)ST細(xì)胞系進(jìn)行了種屬及交叉污染鑒定，可以為其他動(dòng)物源細(xì)胞的種屬鑒定和交叉污染檢測(cè)提供借鑒。相信隨著人們對(duì)細(xì)胞種屬及交叉污染鑒定的日益重視，同工酶分析法將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

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(編輯：李文平)

Identification of ST Cell Line by Isoenzyme Analysis

ZHANG Min，CHEN Xiao-yun，JIANG Tao-zhen，WANG Dong，WANG Lei，WANG Jing-wen

(ChineInstituteofVeterineryDrugControl,Beijing100081,China)

In order to identify the species and purity of ST cell line，three isoenzymes of lactic dehydrogenase(LD),glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) and nucleotide phosphate dehydrogenase(NP) were analysed in this paper.The results showed that the three isoenzymes bands of ST cell line and the swine testicle primary cell culture were consistent,and there is no redundant bands.It indicates that ST cell line and the swine testicle primary cell are the same species,and there is no cross contamination from other species cells.This research provides the reference to other animal origin cells on species identification or cross contamination detection.

ST cell line; isoenzyme; species identification; cross contamination

張敏，碩士，從事動(dòng)物細(xì)胞與病毒學(xué)研究。E-mail:zmbooksea@163.com

2015-10-15

A

1002-1280 (2015) 12-0006-04

Q813.1+1