TBPA氣相暴露對肺毒性的研究

龍金烈，黃長江

(溫州醫(yī)科大學(xué)環(huán)境安全與健康風(fēng)險評估研究院，浙江溫州 3 25035)

四溴雙酚A(TBBPA)是目前全球生產(chǎn)量和使用量最大的溴代阻燃劑之一［1］，被廣泛用于電器、各種電子設(shè)備、紡織品、家具等日常商品中，無論是反應(yīng)型還是添加型產(chǎn)品都會將TBBPA及其代謝物釋放到環(huán)境 (土壤、沉積物、水體和大氣)中去，并在相應(yīng)的介質(zhì)中檢測出［2］。TBBPA性質(zhì)會隨著外界環(huán)境的改變而產(chǎn)生變化，如當(dāng)pH值升高時，可增加TBBPA的溶解性和遷移能力［3］。據(jù)日本相關(guān)報道，TBBPA在土壤和沉積物中的濃度范圍分別為0.5～140μg·kg-1(干重)和2～150μg·kg-1(干重)［4-5］，在電器回收廠的室內(nèi)氣體可檢測出TBBPA［6］，生產(chǎn)地附近空氣可檢測出TBBPA，其中的濃度約1.8 μg·m-3［7］，根據(jù)資料表明，我國青島和珠江三角洲近岸海域底泥中均檢測到TBBPA［8］，在我國廣東貴嶼某電子垃圾拆解點(diǎn)附近大氣中TBBPA的濃度范圍為66.01～95.04 ng·m-3，上海和臺州典型電子廢棄物拆解場地、廢棄電視機(jī)拆解廠中，TBBPA在人工拆解的廢棄物中的含量為557 ng·g-1，灰塵中TBBPA的含量與材料中的濃度分布密切相關(guān)［9］。有關(guān)TBBPA毒性作用研究報道不少，如:肺組織免疫作用的改變［10］、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)［11-12］、生殖［13］及肝腎毒性［14］等等，但關(guān)于TBBPA的氣相暴露對肺毒性的研究，至今國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。目前認(rèn)為空氣顆粒物(particulate matter，PM)污染與呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、肺癌等密切相關(guān)，粒徑＜2.5μm的PM進(jìn)入肺后可與肺泡巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞作用，刺激釋放各種細(xì)胞因子，導(dǎo)致肺炎癥和肺纖維化［15］。本研究通過模擬浙江臺州地區(qū)電子垃圾拆卸地附近的空氣PM中TBBPA的含量并以小鼠作為模型進(jìn)行肺毒性相關(guān)研究，為評估電子廢棄物拆解回收的環(huán)境風(fēng)險及采取相應(yīng)改善措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

氣相暴毒柜 (天津合普公司)，臺式低溫高速離心機(jī)、微量移液器及QPCR儀器 (5417R，德國Eppendorf公司)，超純水器 (UPWS-1-20T，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司)，精密電子天平(Satorius BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，顯微鏡 (Olympus CX31RTSF，Japan)，24孔無菌細(xì)胞培養(yǎng)板及1.5 mL離心管 (碧云天生物技術(shù)研究所)，-80℃超低溫冰箱 (美國 Thermo Forma公司)。

供試試劑有DMSO(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心)，TBBPA(Sigma-Aldrich，USA)，MDA、BCA總蛋白測定試劑盒、T-AOC、LDH(乳酸脫氫酶)、PBS緩沖液、灌胃針 (碧云天生物技術(shù)研究所)，瑞氏染液 (珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、QPCR試劑 (大連寶生物工程有限公司)。

供試動物為8周齡雄性ICR小鼠 (購于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠染毒方法

將8周齡ICR雄性小鼠隨機(jī)分為4組(DMSO，DMSO+0.1μg·m-3TBBPA，DMSO+1 μg·m-3TBBPA，DMSO+10 μg·m-3TBBPA)，放入染毒柜子中連續(xù)染毒2個月，每天染毒8 h，上午4 h，下午4 h，中午取出喂食2 h。

1.2.2 肺灌洗液的取樣、細(xì)胞計數(shù)及分類

用灌胃針吸取無鈣、鎂離子中性PBS灌洗肺組織5次，每次量均為1 mL，每次吸取的灌洗液分別放在按號碼標(biāo)記的EP管中，抽取的灌洗液均放置于冰上，第1管上清吸取后保存于-80℃，用于炎癥因子、蛋白等的測定。其余4管上清棄掉，保存下來的細(xì)胞與第1管的細(xì)胞沉淀混合在一起4℃ 300 r·min-1離心4 min，棄掉上清后，向沉淀里加入100μL的無鈣、鎂離子中性PBS中混勻，用于細(xì)胞的總數(shù)的計數(shù)，計數(shù)完之后再4℃300 r·min-1離心4 min，棄掉上清，向沉淀里加入20μL的無鈣、鎂離子中性PBS重懸混勻，接著涂片、晾干、用瑞氏染色液 A液染30 s，B液染1 min，油鏡下每個標(biāo)本計數(shù)200個白細(xì)胞并進(jìn)行分類計數(shù)。

1.2.3 引物的設(shè)計

引物的設(shè)計用primer premier 5.0軟件與NCBI在線驗證相結(jié)合，具體引物見表1。

表1 基因上下游的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相TBBPA對小鼠肺灌洗液的影響

圖1所示，與對照組相比，TBBPA處理組灌洗液中白細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)及多形核白細(xì)胞數(shù)(polymorphonucleocytes，PMNs)均升高，1μg·m-3組的細(xì)胞總數(shù)升高顯著 (P ＜0.05)，1μg·m-3組 (P ＜ 0.01)及10μg·m-3組 (P ＜0.05)的PMNs升高明顯，對巨噬細(xì)胞數(shù)的影響未見統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 小鼠肺灌洗液中的相關(guān)指標(biāo)

TBBPA處理組灌洗液中總蛋白含量、ALP及LDH活性較對照組均升高，10μg·m-3組總蛋白含量升高較為明顯 (P ＜0.05)，1μg·m-3組ALP活性升高明顯 (P＜0.05)。

2.2 氣相TBBPA對小鼠肺組織的影響

如圖2所示，處理組雙肺臟器系數(shù)均不同升高，但未見統(tǒng)計學(xué)差異;TBBPA處理組肺總SOD活性升高，1μg·m-3組升高趨勢相對較大，但均未見統(tǒng)計學(xué)差異;1μg·m-3及10μg·m-3處理組肺MDA含量升高，而0.1μg·m-3組降低，均未見統(tǒng)計學(xué)差異;TBBPA處理組肺 TAOC降低，1μg·m-3組降低趨勢相對較大，但均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2 小鼠肺組織的相關(guān)指標(biāo)

2.3 氣相TBBPA對小鼠肺組織相關(guān)基因的影響

如圖3所示，與對照組相比，TBBPA處理組肺組織SP-A、SP-B、SP-D、CCSP、Cyp1A1基因表達(dá)均有上調(diào)趨勢，其中，1μg·m-3(P ＜0.01)及10μg·m-3組 (P ＜0.05)的 SP-B上調(diào)顯著，1μg·m-3(P ＜0.05)的SP-D上調(diào)顯著，10μg·m-3組的CCSP上調(diào)顯著 (P ＜0.05)。

3 小結(jié)與討論

TBBPA氣相暴露可引起肺組織氧化應(yīng)激作用及炎癥反應(yīng)。研究表明，許多污染物發(fā)揮毒作用的重要環(huán)節(jié)之一是氧化應(yīng)激［16］，李亞寧等［17］研究表明TBBPA對顫蚓具有氧化脅迫作用，包括引起SOD、CAT、GST活性的變化，本研究顯示，處理組中肺組織總SOD有升高趨勢，TAOC有降低趨勢，MDA有升高趨勢，可能是由于TBBPA的氣相暴露引起了氧化脅迫作用并伴隨有脂質(zhì)過氧化物的堆積。另外，處理組肺灌洗液中總細(xì)胞數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)及PMNs數(shù)增加，說明TBBPA的氣相暴露引起了小鼠的氣道炎癥反應(yīng)。TBBPA的毒性與文獻(xiàn)的報道一致，但是，本研究做的是氣相TBBPA毒性機(jī)制研究，在我國空氣污染嚴(yán)峻的今天，氣相TBBPA的毒性機(jī)制研究似乎更有實際意義。

圖3 小鼠肺組織相關(guān)基因表達(dá)情況

TBBPA氣相暴露可引起肺組織細(xì)胞膜損傷。TBBPA暴露后測定小鼠肺灌洗液中總蛋白及ALP發(fā)現(xiàn)這些值均升高，說明氣相TBBPA暴露后引起了肺組織細(xì)胞膜的損傷，從而使總蛋白及ALP從細(xì)胞內(nèi)漏出至胞外。

TBBPA氣相暴露影響肺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝并激發(fā)自身的免疫保護(hù)作用。通常認(rèn)為肺泡上皮由Ⅰ和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞構(gòu)成，在肺損傷修復(fù)過程中，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)變?yōu)棰裥头闻萆掀ぜ?xì)胞［18］，肺表面活性物質(zhì) (PS)是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞分泌的二棕櫚酰卵磷脂等磷脂成分構(gòu)成，有維持肺泡形態(tài)的功能 (降低肺泡表面氣-液表面張力、防止吸氣時肺泡過度膨脹、呼氣時肺泡過度塌陷等)。10%的PS由4種表面活性蛋白構(gòu)成，即SP-A、SP-B、SP-C、SP-D。SP-A及SP-D是親水性蛋白，與PS的代謝及結(jié)構(gòu)有關(guān)，主要功能為參與肺部固有免疫，SP-B及SP-C為疏水性蛋白，能降低肺泡氣液界面的表面張力［19］。本研究通過QPCR實驗發(fā)現(xiàn):與對照組相比，處理組肺組織SP-B及SP-D基因上調(diào)，說明TBBPA氣相暴露肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝的改變，并激發(fā)了自身的免疫功能，達(dá)到機(jī)體自身保護(hù)的目的。

TBBPA氣相暴露可激發(fā)自身抗炎及抗纖維化作用。Lesur等研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者肺泡液中的CCSP較對照組的低［20］，大鼠肺間質(zhì)纖維化CCSP陽性細(xì)胞較對照組明顯減少［21］，上述研究結(jié)果均表明CCSP具有抗纖維化作用。本研究通過QPCR實驗發(fā)現(xiàn):與對照組相比，處理組肺組織CCSP較對照組上調(diào)。說明TBBPA氣相暴露激發(fā)自身了機(jī)體抗炎及抗纖維化作用。

TBBPA氣相暴露可激發(fā)肺組織自身代謝功能。通常認(rèn)為，細(xì)胞色素P450是重要的參與藥物水解、還原、氧化的I相反應(yīng)代謝酶，使所催化的藥物極性增大，利于與Ⅱ相反應(yīng)中與內(nèi)源性小分子(如乙酰基、谷胱甘肽、葡萄糖醛酸)結(jié)合，從膽汁和腎臟排出。目前，發(fā)現(xiàn)哺乳動物存在14個P450基因家族，26個基因亞家族，CYP1家族基因定位于第15號染色體上，包括 Cyp1A1和Cyp1A2。本研究通過QPCR實驗發(fā)現(xiàn):與對照組相比，處理組肺組織Cyp1A1較對照有上調(diào)趨勢。有可能肺組織中的Cyp1A1基因參與了由于氣相暴毒而進(jìn)入肺內(nèi)的TBBPA的代謝作用，利于后者的排出。

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