反硝化細(xì)菌對生物濾池濾料掛膜及水處理效果的初步研究

張 濤，周朝生*，羅海忠，吳洪喜，馬建忠，胡利華，胡 園

(1.浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所，浙江溫州 325000;2.舟山市水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316000)

近年來，隨著勞動力成本增加、水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中病害的頻發(fā)和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的需要，人們開始由傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式逐步轉(zhuǎn)向工廠化養(yǎng)殖模式［1-2］。工廠化養(yǎng)殖模式的關(guān)鍵技術(shù)是水處理技術(shù)［3］:第一要去除養(yǎng)殖污水中的固體物;第二是控制養(yǎng)殖水體中的溶解氧;第三是殺菌消毒;第四是降解溶解性有機(jī)物［4］。然而降解溶解性有機(jī)物，主要依靠微生物技術(shù)［5-6］。反硝化細(xì)菌就是一類能將硝態(tài)氮(NO3-N)還原為氣態(tài)氮 (N2)的微生物，在分類學(xué)上，它們散布于10個不同的細(xì)菌科中，已知50個屬以上的微生物能夠進(jìn)行反硝化反應(yīng)［7］，其中大部分為厭氧細(xì)菌。由于養(yǎng)殖水體一般需要充足的溶氧環(huán)境才能保證養(yǎng)殖水體中動植物正常的新陳代謝，因此在養(yǎng)殖水體中，就需要找到適宜的好氧反硝化細(xì)菌加以開發(fā)利用。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在自然界中存在著大量的好氧反硝化細(xì)菌。最早對好氧反硝化細(xì)菌的研究始于20世紀(jì)80 年代［8］，Robertson 等［9］在除硫和反硝化處理系統(tǒng)出水口處首次分離出好氧反硝化菌泛氧副球菌 (Paracoccus pantotropha)、假單胞菌屬的1種(Pseudomonas spp)和糞類堿菌(Alcaligenes facalis)等。近年來國內(nèi)外的專家學(xué)者不斷發(fā)現(xiàn)好氧反硝化細(xì)菌［10］:Su 等［11］分離到的菌株 NS-2，可在92%氧體積分?jǐn)?shù)條件下進(jìn)行反硝化;謝曙光等［12］對地表水處理中好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行探討性研究，在水力負(fù)荷較高的情況下獲得總氮去除率達(dá)20% ～30%的效果;丁愛鐘等［13］則從土壤中分離出一種兼性細(xì)菌DH11，發(fā)現(xiàn)其能在好氧條件下還原硝酸鹽;馬放等［14］從活性污泥中分離到好氧反硝化菌株X31，好氧培養(yǎng)40 h后對總氮脫除率超過50%。這些研究成果為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中降解溶解性有機(jī)物提供了可能。

本試驗(yàn)采用陶瓷環(huán)和生化環(huán)2種掛膜濾料，在試驗(yàn)過程中添加的反硝化細(xì)菌為商品反硝化細(xì)菌和筆者分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌。本試驗(yàn)旨在找出一種更適應(yīng)工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的反硝化細(xì)菌，從而為水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

商品反硝化細(xì)菌 (凈硝1號)和實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌，200 L的玻璃缸18個，陶瓷環(huán)64 L，生化環(huán)64 L，水泵 (1 000 L·h-1)18個，15 mm PVC管18根。選擇掛膜材料有生化環(huán)和陶瓷環(huán)。生化環(huán)規(guī)格為內(nèi)徑×外徑×高為7.0 mm×7.5 mm×7.0 mm，材質(zhì)為聚乙烯，比表面積310 m2·m-3，黃色。陶瓷環(huán)的規(guī)格為內(nèi)徑×外徑×高為9 m×17 mm×17 mm，材質(zhì)陶瓷，比表面積300 m2·m-3，白色。

1.2 方法

1.2.1 配制養(yǎng)殖污水

污水培養(yǎng)試劑有氯化氨、亞硝酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀。向200 L的玻璃缸中添加100 L的新鮮海水，再添加氯化氨、亞硝酸鈉、鄰苯二甲酸氫鉀，使新添加的新鮮海水中亞硝酸、氨氮和COD的濃度分別為5.0，2.5，10.0 mg·L-1，然后分別放進(jìn)64 L的生物掛膜材料。

1.2.2 培養(yǎng)基配制

選擇培養(yǎng)基。葡萄糖24 g，檸檬酸鈉14.7 g，硝酸鉀6.7 g。

分離培養(yǎng)基。葡萄糖10 g，檸檬酸鈉5 g，醋酸鈉1.5 g，氯化氨1.0 g，磷酸氫二鈉0.6 g，磷酸二氫鉀0.4 g，硫酸鎂0.1 g，酵母膏0.5 g，瓊脂粉20 g，陳海水 1 000 mL，pH值 7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。

活化培養(yǎng)基。葡萄糖10 g，檸檬酸鈉5 g，醋酸鈉1.5 g，氯化氨1.0 g，硝酸鉀1.0 g，磷酸氫二鈉0.6 g，磷酸二氫鉀0.4 g，硫酸鎂0.1 g，氯化亞鐵0.1 g，酵母膏0.5 g，陳海水1 000 mL，pH值7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。

亞硝酸鹽還原培養(yǎng)基。牛肉膏10 g，蛋白胨5 g，KNO31 g，pH值7.0～7.6，121℃高壓滅菌20 mim。

篩選培養(yǎng)基。A培養(yǎng)基:葡萄糖36 g，酵母膏0.5 g，亞硝酸鈉2.1 g，陳海水1 000 mL，pH值7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。B培養(yǎng)基:葡萄糖36 g，酵母膏0.5 g，硝酸鹽鈉2.6 g，陳海水1 000 mL，pH值 7.6～8.2，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

從舟山市水產(chǎn)研究所朱家尖基地大黃魚養(yǎng)殖車間污水處理池中獲得養(yǎng)殖污水，對其進(jìn)行營養(yǎng)強(qiáng)化。加入反硝化細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)反硝化細(xì)菌，然后對反硝化細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，提純反硝化細(xì)菌。再加入活化培養(yǎng)基，對反硝化細(xì)菌進(jìn)行活化培養(yǎng)。為驗(yàn)證反硝化細(xì)菌的還原性，同時加入亞硝酸鹽還原培養(yǎng)基。最后，提取反硝化細(xì)菌DNA，鑒定實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌。

開啟循環(huán)泵運(yùn)行循環(huán)養(yǎng)殖用水，當(dāng)循環(huán)水運(yùn)轉(zhuǎn)到第4天時，向玻璃缸中分別添加商品反硝化細(xì)菌和實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌。添加前采用無菌雙蒸水對二者進(jìn)行稀釋，在紫外線分光光度計下測量二者的吸光值都在2.0的情況下時，分別吸取45 mL的商品反硝化細(xì)菌和實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌予以添加，以控制其相同試驗(yàn)濃度。當(dāng)循環(huán)水運(yùn)行至第10天時，再向每個玻璃缸中追加相同體積和密度的10 mL不同來源的反硝化細(xì)菌。各試驗(yàn)組設(shè)置不添加反硝化細(xì)菌的空白對照組。培養(yǎng)條件:28～32℃，溶解氧 6～8 mg·L-1，鹽度2.80% ～3.23%，pH值7.8～8.5。

1.3 測定項(xiàng)目及數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源反硝化細(xì)菌對的降解情況

圖1 濃度的變化

2.2 不同來源反硝化細(xì)菌對的降解情況

通過圖2可知，在各試驗(yàn)組運(yùn)行前期，亞硝酸鹽含量都有輕微上升的趨勢，其中分離培養(yǎng)反硝化細(xì)菌生化環(huán)試驗(yàn)組濃度最高，達(dá)到5.8 mg·L-1，這比試驗(yàn)初始濃度高出0.8 mg·L-1。試驗(yàn)運(yùn)行到第9天以后，陶瓷環(huán)組亞硝酸鹽含量開始下降，試驗(yàn)運(yùn)行12 d后，生化環(huán)組亞硝酸鹽含量開始下降;15 d后，陶瓷環(huán)和生化環(huán)空白對照組亞硝酸鹽含量開始下降;21 d前后，各試驗(yàn)組降解亞硝酸鹽速率都開始下降，其降解趨勢也變得比較平緩。添加反硝化細(xì)菌陶瓷環(huán)組試驗(yàn)組中，分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌組在試驗(yàn)前期的亞硝酸鹽濃度比商品反硝化細(xì)菌組高，進(jìn)入降解期時，分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌組亞硝酸鹽濃度低于商品反硝化細(xì)菌組，且降解性能穩(wěn)定。添加反硝化細(xì)菌生化環(huán)組剛開始分離培養(yǎng)反硝化細(xì)菌試驗(yàn)組中亞硝酸鹽含量濃度要比商品反硝化細(xì)菌試驗(yàn)組高，試驗(yàn)進(jìn)入快速降解初期，分離培養(yǎng)反硝化細(xì)菌組的濃度要比商品反硝化細(xì)菌高，直到試驗(yàn)運(yùn)行18 d后，分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌試驗(yàn)組中亞硝酸鹽含量才比商品反硝化細(xì)菌組低。試驗(yàn)運(yùn)行至30 d時，檢測到添加分離培養(yǎng)反硝化細(xì)菌陶瓷環(huán)組和商品反硝化細(xì)菌陶瓷環(huán)組的亞硝酸鹽濃度分別為0.07和0.11 mg·L-1，添加分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌生化環(huán)組和商品反硝化細(xì)菌生化環(huán)組的亞硝酸鹽濃度分別為0.09和0.13 mg·L-1。對照組中，15 d前，陶瓷環(huán)亞硝酸鹽含量較生化環(huán)高，15 d后比生化環(huán)低。綜上，分離培養(yǎng)反硝化細(xì)菌陶瓷環(huán)組降解亞硝酸鹽效果最好，同時，試驗(yàn)組和對照組降解亞硝酸鹽差異明顯，添加反硝化細(xì)菌試驗(yàn)組降解NO-2較未添加的對照組效果要好。

圖2 濃度的變化

2.3 不同來源反硝化細(xì)菌對COD的降解情況

由圖3可知，不同材料添加不同來源反硝化細(xì)菌，各試驗(yàn)組降解COD的變化趨勢基本一致，即COD的降解速率較平緩。試驗(yàn)運(yùn)行30 d，不同來源反硝化細(xì)菌降解COD差異性不明顯，且降解COD的效果不理想，對COD的去除率僅為30.9%～37.9%。其中，分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌陶瓷環(huán)試驗(yàn)組降解COD的去除率最高，為37.9%;而添加分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌生化環(huán)組降解COD去除率為35.5%，二者均為所在各自試驗(yàn)組中去除COD的效率最高。由此說明，分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌降解COD效果最好。

圖3 COD濃度的變化

3 小結(jié)與討論

2種不同來源的反硝化細(xì)菌對NH+4降解效果較明顯，均在98.9%以上。其中陶瓷環(huán)組，實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)反硝化細(xì)菌和商品反硝化細(xì)菌對NH+4的降解效率分別為99.4%和97.6%;生化環(huán)組，實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌和商品反硝化細(xì)菌對的降解效率分別為96.4%和95.6%。通過陶瓷環(huán)和生化環(huán)添加不同來源反硝化細(xì)菌進(jìn)行比對可得出結(jié)論，即分離培養(yǎng)的反硝化細(xì)菌較商品反硝化降解效率要高。而添加反硝化細(xì)菌試驗(yàn)組和空白對照組比較顯示，對照組比添加反硝化細(xì)菌試驗(yàn)組對的降解效率較低，且降解效果也較理想，均在96.5%以上。

添加不同來源反硝化細(xì)菌的陶瓷環(huán)和生化環(huán)降解COD的效果不很理想，且各試驗(yàn)組降解COD的差異不明顯，去除率在35.5% ～37.9%，還需進(jìn)一步研究和討論。

本次試驗(yàn)所用的養(yǎng)殖污水均采用化學(xué)試劑配制模擬，雖試驗(yàn)達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，也探討了各種掛膜濾料降解養(yǎng)殖污水性能的差異，但考慮到試驗(yàn)要貼近生產(chǎn)實(shí)踐，故接下來應(yīng)采用養(yǎng)殖生產(chǎn)池中產(chǎn)生的養(yǎng)殖污水來進(jìn)行試驗(yàn)并加強(qiáng)觀察和記錄。下一步擬考慮在試驗(yàn)組的玻璃缸中養(yǎng)殖一定密度的水產(chǎn)動物，結(jié)合觀察水產(chǎn)動物的生長習(xí)性，總結(jié)添加反硝化細(xì)菌對其生長的影響，為養(yǎng)殖生產(chǎn)提供理論參考。

［1］ 劉祥軍.試談水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的用藥安全問題 ［J］.養(yǎng)殖與飼料，2008(8):2-5.

［2］ Bo Z L，Zhou W X.Study on the release of grouper Epinephelus for Stock enhancement［J］.Marine Science Bulletin，2003，5(1):88-98.

［3］ 韓世成，曹廣斌，蔣樹義，等.工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖中的水處理技術(shù) ［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志，2009(3):2-7.

［4］ 張濤.工廠循環(huán)水養(yǎng)殖生物濾料的選擇和反硝化細(xì)菌的應(yīng)用［D］.舟山:浙江海洋學(xué)院，2013.

［5］ 余欣欣，李建洲，陳立秀，等.微生物和酶在降解環(huán)境有機(jī)污染物中的應(yīng)用［J］.環(huán)境工程，2012(2):2-9.

［6］ Le Moullac G，Haffner P.Environmental factors affecting immune responses in Crustacea［J］.Aquaculture，2000，191(1/3):121-131.

［7］ 吳美仙，李科，張萍華，等.反硝化細(xì)菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報，2008，31(4):1-8.

［8］ Odd-lvar L，Helge K.Efficiency of nitrification in trickling filters using different filter media ［J］. Aquacultural Engineering，2000，21(3):181-199.

［9］ 龐德紅，柳知非.好氧反硝化脫氮機(jī)理及處理NOx廢氣的展望 ［J］.污染防治技術(shù)，2010，23(3):1-9.

［10］ 何芳.好氧反硝化細(xì)菌的篩選 ［D］.揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué)，2006:21-26.

［11］ 王弘宇，馬放，蘇俊峰，等.好反硝化菌株的鑒定及其反硝化特性研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2007(7):1-7.

［12］ 項(xiàng)幕飛.好氧反硝化菌的分離篩選和鑒定研究 ［D］.北京:北京工商大學(xué)，2007.

［13］ 丁愛鐘，傅家謨，盛國英.好氧生物反硝化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)［J］.科學(xué)通報，2000(459):2779-2782.

［14］ Thompson F L，Abrea P C，Wasielesky W.Importance of biofilm for water quality and hourishment in intensive shrimp culture［J］.Aquaculture，2002，203(3/4):263-278.

［15］ 姜輝.工廠化養(yǎng)殖水處理方法及預(yù)排污系統(tǒng)的研究和設(shè)計［D］.青島:中國海洋大學(xué)，2007.

［16］ 葉俊.亞硝酸鹽急性脅迫對草魚血液生理生化指標(biāo)和非特異性免疫性能的影響［D］.武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.