淋巴細(xì)胞免疫分型對(duì)間質(zhì)性肺病變的臨床分析

劉培培，姜悅垚，侯松萍*

(1．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2．吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

淋巴細(xì)胞免疫分型對(duì)間質(zhì)性肺病變的臨床分析

劉培培1，姜悅垚2，侯松萍1*

(1．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2．吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130021)

摘要：目的探討外周血淋巴細(xì)胞免疫分型及NK細(xì)胞水平變化對(duì)于間質(zhì)性肺病變的原因是結(jié)締組織疾病所致，還是其它原因所致的臨床價(jià)值。方法50例間質(zhì)性肺病變患者，分結(jié)締組織疾病組、非結(jié)締組織疾病組，每組25例；正常對(duì)照組25例，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD3+、CD4+、CD8+、CD56+NK細(xì)胞、CD19+B淋巴細(xì)胞表達(dá)水平，比較三組間的外周血淋巴細(xì)胞各亞群的差異。結(jié)果結(jié)締組織疾病組與非結(jié)締組織疾病組相比，CD8+T細(xì)胞明顯增高(P<0.01);結(jié)締組織疾病組與正常對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞也明顯增高,但CD56+數(shù)明顯降低,均P<0.05;非結(jié)締組織疾病組與正常對(duì)照組相比，外周血T 細(xì)胞各亞群均無(wú)明顯差異。結(jié)論結(jié)締組織疾病組外周血CD8+T細(xì)胞明顯增高、NK細(xì)胞數(shù)明顯降低；非結(jié)締組織疾病組外周血T 細(xì)胞各亞群未見(jiàn)明顯異常，提示外周血淋巴細(xì)胞免疫分型有助于識(shí)別免疫性損傷引起的結(jié)締組織疾病并發(fā)間質(zhì)性肺病變。

關(guān)鍵詞：結(jié)締組織疾??；非結(jié)締組織疾?。婚g質(zhì)性肺?。涣馨图?xì)胞亞群；NK細(xì)胞

(ChinJLabDiagn,2015,19:2066)

彌漫性間質(zhì)肺疾病(DILD)是一組臨床特征相似，免疫病理過(guò)程各異的眾多肺疾病組成的疾病譜，病因不明者占65%，其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚[1]。病毒、細(xì)菌、真菌、吸入有害氣體、藥物、風(fēng)濕病等均可導(dǎo)致間質(zhì)性肺病。ILD涵蓋許多疾病,各有其臨床特點(diǎn),診斷有其難處,治療和預(yù)后又因診斷而異[2]。本文通過(guò)檢測(cè)結(jié)締組織疾病患者、非結(jié)締組織疾病患者和正常人的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型，探討其對(duì)于間質(zhì)性肺病變的原因是免疫損傷，還是非免疫損傷所致提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1臨床資料選取吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院于2012年5月至2014年5月期間收治的50間質(zhì)性肺病變患者。其中25例結(jié)締組織疾病并發(fā)間質(zhì)性肺病變患者，診斷按2012年風(fēng)濕病新版全套指南標(biāo)準(zhǔn)[3]，年齡24-80歲，平均 54.2±16.8 歲,其中男11例，女14例，結(jié)締組織疾病組病種構(gòu)成為：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎7例，多發(fā)性肌炎7例， 皮肌炎4例，干燥綜合征4例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡3例。25例非結(jié)締組織疾病并發(fā)間質(zhì)性肺病變患者，年齡26-80歲，平均 57.8±15.5 歲,其中男10例，女15例。非結(jié)締組織疾病組病種構(gòu)成為：繼發(fā)于感染5例，藥物性 3例，胃食管反流 3例，原因不明 14例。兩組患者胸部CT影像主要表現(xiàn)：兩肺彌漫性分布的磨玻璃影、網(wǎng)狀陰影，有時(shí)可見(jiàn)牽引性支氣管擴(kuò)張。另選取25例健康人作為正常對(duì)照組，年齡30-77歲，平均 52.2±15.7 歲，其中男13例，女性12例。結(jié)締組織疾病組3例、非結(jié)締組織疾病組2例患者采取淋巴細(xì)胞免疫分型血液標(biāo)本前使用激素，其余患者及健康對(duì)照組均未使用糖皮質(zhì)激素。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3- PC5(貨號(hào)：6607013)；細(xì)胞裂解液：OptiLyse○RNO-lysing Solution(貨號(hào)：A11894)；流式細(xì)胞儀：Beckman Coulter FC500；以上所有試劑均購(gòu)自美國(guó)Beckmen Coulter公司。

1.2.2血液樣本制備采集患者及正常健康人外周血2 ml，加入到EDTA抗凝的真空管中，混勻。取三只流式細(xì)胞儀上樣管，分別命名為同型對(duì)照管和實(shí)驗(yàn)管1和實(shí)驗(yàn)管2，每管中均加入100 μl抗凝全血，然后分別加入?20μl同型對(duì)照抗體和CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5抗體和CD45-FITC/CD56-PE/CD19-ECD/CD3-PC5，充分混勻，避光室溫孵育15 min；然后向每管中加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，充分混勻，避光孵育10 min后加入500 μl PBS，1000 r/min離心5 min，棄上清，每管加入500 μl鞘液，混勻，等待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3指標(biāo)測(cè)定外周血淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞檢測(cè)均采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，由我院中心實(shí)驗(yàn)室專人操作檢測(cè)。

2結(jié)果

外周血T細(xì)胞各亞群檢測(cè)結(jié)果：結(jié)締組織疾病組與非結(jié)締組織疾病組相比，CD8+T細(xì)胞明顯增高(P<0.01);結(jié)締組織疾病組與正常對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞也明顯增高,但CD56+數(shù)明顯降低,均P<0.05;非結(jié)締組織疾病組與正常對(duì)照組相比，外周血T細(xì)胞各亞群均無(wú)明顯差異。見(jiàn)表1。

表1　各組外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果比較±s)

注:與非結(jié)締組織疾病組比較，ΔP<0.05;與正常對(duì)照組比較，*P<0.05

3討論

急性間質(zhì)性肺疾病或發(fā)作性間質(zhì)性肺疾病病情進(jìn)展迅速，死亡率高，短期內(nèi)出現(xiàn)呼吸功能衰竭，做支氣管-肺泡灌洗液方面的檢查，病人及家屬難以接受，醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)也很大。尤其結(jié)締組織病患者出現(xiàn)急性間質(zhì)性肺病變時(shí),很難判斷是長(zhǎng)期用激素或免疫抑制劑治療，合并了真菌、病毒感染；還是這類病人免疫功能異常用藥及飲食等因素出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)造成急性肺損傷，或是結(jié)締組織病急性活動(dòng)期造成雙肺間質(zhì)彌漫性病變，臨床上很難甄別這些情況。為了挽救病人生命，臨床上經(jīng)常給予大劑量激素和抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒治療，由于治療用藥沒(méi)有準(zhǔn)確的目標(biāo)，不但造成治療費(fèi)用高，而且還易出現(xiàn)各種藥物的不良反應(yīng)，治療效果也很差。為提高對(duì)間質(zhì)性肺病變患者的機(jī)體免疫狀態(tài)評(píng)估能力及免疫損傷是否參與患者肺間質(zhì)病變炎癥反應(yīng)過(guò)程的識(shí)別能力，本文對(duì)結(jié)締組織疾病組、非結(jié)締組織疾病組與健康人的外周血淋巴細(xì)胞免疫分型結(jié)果進(jìn)行比較，研究結(jié)果顯示結(jié)締組織疾病組與非結(jié)締組織疾病組相比，CD8+T細(xì)胞明顯增高(P<0.01)，結(jié)締組織疾病組與正常對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞也明顯增高(P<0.05)，非結(jié)締組織病組與正常對(duì)照組相比，CD8+T細(xì)胞無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。楊亞敏等研究結(jié)果顯示：高活動(dòng)期系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者外周血CD8+細(xì)胞百分率較穩(wěn)定期明顯升高(P<0.01)；李昕等研究結(jié)果顯示：原發(fā)干燥綜合征患者外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05) 和SLE 組(P<0.05),SLE 組外周血CD8+T 淋巴細(xì)胞水平也高于正常對(duì)照組(P<0.05)，CD8+細(xì)胞水平在疾病活動(dòng)期明顯升高 。這兩項(xiàng)研究結(jié)果均提示結(jié)締組織疾病活動(dòng)期外周血CD8+細(xì)胞水平明顯增高。本文結(jié)果表明結(jié)締組織疾病組合并間質(zhì)性肺病變時(shí)，體內(nèi)發(fā)生明顯的免疫功能紊亂，CD8+T細(xì)胞活化，提示CD8+T細(xì)胞在結(jié)締組織疾病肺免疫損傷過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。因此，結(jié)締組織疾病合并間質(zhì)性肺病變時(shí)，T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量及功能改變可提示機(jī)體免疫功能異常，如果能在這個(gè)階段對(duì)機(jī)體的免疫學(xué)異常進(jìn)行干預(yù)，則對(duì)改善結(jié)締組織疾病和肺部病變的治療效果和預(yù)后極其有利。

CD56分子是自然殺傷細(xì)胞 (NK細(xì)胞)表面主要的表面標(biāo)記，NK細(xì)胞不僅是機(jī)體內(nèi)的第一道免疫防御屏障，而且也具有免疫調(diào)節(jié)能力，NK細(xì)胞對(duì)T、B淋巴細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞具有調(diào)控作用(免疫自穩(wěn))。本文研究結(jié)果顯示結(jié)締組織疾病組NK細(xì)胞數(shù)量明顯低于正常對(duì)照組，鄒原方等研究結(jié)果顯示SLE患者外周血CD3+CD56+自然殺傷T細(xì)胞的表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組，該結(jié)果與本文一致[4]。Berzofsky等認(rèn)為，NKT細(xì)胞是一種負(fù)向免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能夠通過(guò)分泌IL-4 等細(xì)胞因子抑制免疫應(yīng)答[5];Wermeling等研究結(jié)果顯示：在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)，iNKT細(xì)胞可以有效清除凋亡小體，進(jìn)而抑制 CD1d+ 自身反應(yīng)性 B淋巴細(xì)胞的激活[6],本文研究結(jié)果NK細(xì)胞數(shù)量下降是否提示結(jié)締組織疾病組機(jī)體B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體，是由于NK細(xì)胞數(shù)量下降，對(duì)T、B淋巴細(xì)胞調(diào)控作用減弱所致，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

非結(jié)締組織疾病組與正常對(duì)照組相比，外周血T 細(xì)胞各亞群無(wú)明顯差異，提示不一定需要激素或免疫抑制劑控制炎癥反應(yīng)，更應(yīng)該積極尋找肺間質(zhì)病變的原因，去除致病因素，給予相應(yīng)治療。

總之，間質(zhì)性肺病變患者的外周血T 細(xì)胞各亞群的變化令人關(guān)注,尤其是哪些間質(zhì)性肺病變的重癥患者、臨床上難以實(shí)施支氣管-肺泡灌洗液方面的檢查，值得擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究，以揭示外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)在彌漫性間質(zhì)性肺疾病甄別肺損傷是否免疫損傷所致的作用，為指導(dǎo)治療方向提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李振華.支氣管-肺泡灌洗液檢查在彌漫性間質(zhì)性肺疾病中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2013，25(1)：2.

[2]朱元玨.間質(zhì)性肺疾病的診斷和治療進(jìn)展[J].臨床肺科雜志,2007，12(1)：1.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì).風(fēng)濕病新版全套指南.2012年2月18日修改版.

[4]鄒原方，羅婉瑩，郭少卿,等.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血CD3+CD56+自然殺傷T細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2014,35(8):967.

[5]Berzofsky JA，Terabe M．NKT cells in tumor immunity：opposing subsets define a new immunoregulatory axis[J]．J lmmunol，2008，180(6)：3627．

[6]Wermeling F，Lind SM，Jordo ED，et al．Invafiant NKT cells limit activation of autoreactive CDld-positive B cells[J]．J Exp Med，2010，207(5)：943．

The clinical analysis of peripheral blood lymphocyte immunophenotyping in interstitial lung lesionsLIUPei-pei1，JIANGYue-yao2，HOUSong-ping1*.(1.DepartmentofRespiratoryMedicine,China-JapanUnionHospital,JiLinUniversity,Changchun130033,China；2.CollegeofPharmacy，JiLinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the clinical value of peripheral blood lymphocyte immunophenotyping and CD56+NK cell levels in interstitial lung disease due to connective tissue diseases or other causes.Methods50 patients with interstitial lung lesions，divided into connective tissue disease group，non-connective tissue disease group， 25 cases in each group.25 cases of healthy as the normal control.The levels ofCD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in the three groups were determined by a flow cytometry；compared differences between three groups of peripheral blood lymphocyte subsets.ResultsCompared with the non-connective tissue disease group，the levels of CD8+ cells in the connective tissue disease group were significantly higher (P<0.01);compared with the normal control group,the levels of CD8+ cells were also significantly higher， but CD56+NK cells were lowered in the connective tissue disease group(both P<0.05)；compared with the normal control group,the levels of CD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in non-connective tissue disease group had no obvious changes(P>0.05).ConclusionThe levels of CD8+cells in peripheral blood were significantly higher， but CD56+NK cells were lowered in the connective tissue disease group；the levels of CD3+,CD4+,CD8+,CD56+NK,CD19+B cell in peripheral blood in non-connective tissue disease group had no obvious abnormal.It prompted that peripheral blood lymphocyte immunophenotyping helps to identify immune injury of the connective tissue disease complicated with interstitial lung disease.

Key words:Connective tissue disease;Non-connective tissue disease;Interstitial lung diseases;Lymphocyte subsets;NK cell

(收稿日期：2015-01-12)

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：R563.1

文章編號(hào)：1007-4287(2015)12-2066-03

*通訊作者