雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A對小鼠腹腔心臟移植急性排斥反應(yīng)的影響

雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A對小鼠腹腔心臟移植急性排斥反應(yīng)的影響

王遠(yuǎn)濤1，胡鈺2，陳默1，周洪瀾1，傅耀文1，王偉剛1*

(1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院 泌尿外二科,吉林 長春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科)

器官移植仍是目前治療終末期器官衰竭最有效的辦法[1,2]?；颊咝柰ㄟ^長期服用免疫抑制藥物來維持移植器官的存活及其正常功能。環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)是目前臨床最常見的免疫抑制劑之一,但由于患者需長期服用，毒副作用強，并且費用高昂。因此，尋找新型免疫抑制劑，降低毒性損傷，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是目前移植領(lǐng)域研究的熱點之一。雷公藤作為傳統(tǒng)中藥材，具有抗炎、免疫抑制作用，可以治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]等自身免疫性疾病[4]。雷公藤多甙(tripterium wilfordii hook f ，TWHF)作為雷公藤提取物，其免疫抑制功效優(yōu)于雷公藤本身[5,6]。本實驗使用雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A，觀察對小鼠腹腔心臟移植物存活時間的影響、移植急性排斥反應(yīng)的組織學(xué)變化、受體外周血CD4+和CD8+T細(xì)胞比例變化等情況，尋找新型免疫抑制方案。

1材料與方法

1.1實驗動物

近交系C57BL/6、BALB/C小鼠各40只，雌性，6-8周齡，體重18-20 g，SPF級，由吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院動物實驗中心提供。

1.2主要藥物與試劑

環(huán)孢素A及雷公藤多甙均由吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院藥劑科提供，Percpcy5.5標(biāo)記的Anti-mouse CD4抗體和PE標(biāo)記的Anti-mouse CD25抗體購于美國BD公司。

1.3實驗分組

C57BL/6和BALB/C共80只小鼠按照隨機數(shù)字表法分為4組，每組10對，BALB/C小鼠為供體，C57BL/6小鼠為受體，給予腹腔心臟移植手術(shù)處理。對照組：每日腹腔注射生理鹽水；雷公藤多甙組：雷公藤多甙 25 μg/(g·d)腹腔注射；環(huán)孢素A組：環(huán)孢素A 2.5 μg/(g·d)腹腔注射；聯(lián)合用藥(環(huán)孢素A+雷公藤多甙)組：雷公藤多甙 25 μg/(g·d)+ 環(huán)孢素A 2.5 μg/(g·d)腹腔注射。

1.4小鼠腹腔心臟移植模型的建立

1.4.1麻醉方法2%戊巴比妥鈉按5 μl/g腹腔注射，以小鼠意識、尾部和下肢痛覺消失為宜，麻醉效果不佳時可追加2-5 μl。

1.4.2供體準(zhǔn)備BALB/C小鼠麻醉成功后取仰臥位，消毒腹部皮膚，沿正中線剪開皮膚及腹膜，暴露下腔靜脈，灌注肝素生理鹽水(100 U/ml)1 ml。迅速沿兩側(cè)腋前線剪開胸廓，用5-0絲線分別結(jié)扎上下腔靜脈，離斷肺動脈，沿主動脈向心臟內(nèi)灌注5 ml預(yù)冷生理鹽水，離斷升主動脈。用5-0絲線從心臟后方集束結(jié)扎其余血管，離斷結(jié)締組織，將取下的供心置于4℃生理鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3受體準(zhǔn)備 C57BL/6小鼠麻醉成功后取仰臥位，消毒腹部皮膚，沿正中線剪開皮膚及腹膜，撥開腸管充分暴露腹主動脈與下腔靜脈，小心并盡可能去除其周圍的結(jié)締組織。

1.4.4供心移植 用5 mm微血管夾于雙側(cè)腎血管及髂血管水平以阻斷血流，在腹主動脈與下腔靜脈表面各剪開與供心主動脈和肺動脈直徑相當(dāng)?shù)臋E圓形小口。用12-0顯微縫合線行供心主動脈與受體腹主動脈的端側(cè)吻合，再行供心肺動脈與受體下腔靜脈的端側(cè)吻合，5-0絲線連續(xù)縫合關(guān)閉腹腔。

1.4.5術(shù)后監(jiān)測 術(shù)后通過觸摸小鼠腹部心臟搏動情況判斷供心功能，搏動消失即為供心停跳，視為移植物排斥。

1.5標(biāo)本收集

每組6只小鼠每日腹部觸診，觀察移植心存活情況。移植后第5日，每組殺4只小鼠。收集外周血，部分使用淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，4℃保存進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測備用，同時收集移植心，浸泡于10%福爾馬林中保存，組織學(xué)形態(tài)觀察備用。

1.6蘇木精伊紅(H&E)染色

取下的供心進(jìn)行常規(guī)脫水包埋，并進(jìn)行石蠟切片、烘片。玻片加入二甲苯I 15 min ，二甲苯Ⅱ 5 min，梯度乙醇脫水各5 min 。自來水充分清洗后加入蘇木素染色15 min，自來水清洗。加入鹽酸乙醇分化10 s，自來水沖洗。加入返藍(lán)液33 s，自來水沖洗。再加入伊紅溶液染色2 min，自來水沖洗。最后逐級升濃度乙醇脫水，再加入二甲苯I、二甲苯II各5 min 。蓋玻片下甘油封片，進(jìn)行光鏡觀察。

1.7外周血CD4+ 及CD8+T細(xì)胞檢測

小鼠下頜靜脈取血，肝素(500 U/ml)50 μl抗凝，與PBS混合后緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液，4℃，1 650 rpm/min 離心5 min，分離白膜層，加入2 ml PBS重懸，4℃，1 650 rpm/min離心5 min，棄上清，用流式洗液FACs Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為3*105/100 μl，加入Percpcy5.5標(biāo)記的Anti-mouse CD4抗體和PE標(biāo)記的Anti-mouse CD8稀釋液各10 μl，混勻，4℃避光孵育30 min，加入2 ml FACs Buffer離心洗滌，棄上清，加入250 μl FACs Buffer，流式細(xì)胞儀上機檢測CD4+ 及CD8+T細(xì)胞所占百分比。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

2結(jié)果

2.1雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A對異位移植心存活時間的影響

通過術(shù)后每日觸摸小鼠腹部心臟搏動情況，對照組(n=10)異位移植心平均存活時間為9.10±0.99天，雷公藤多甙組(n=9)異位移植心平均存活時間為12.00±1.00天，環(huán)孢素A組(n=9)異位移植心平均存活時間為11.78±0.83天，雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A組(n=10)異位移植心平均存活時間為15.90±1.29天。聯(lián)合用藥組相比對照組及單獨用藥組，均顯著延長異位移植心存活時間(P<0.05)，異位移植心生存曲線見圖1。

圖1　腹腔心臟移植生存曲線

2.2移植心組織學(xué)形態(tài)觀察

收集各組小鼠術(shù)后第5日移植心，H&E染色后鏡下觀察：對照組心肌細(xì)胞明顯水腫，結(jié)構(gòu)被破壞，間質(zhì)彌漫大量炎性細(xì)胞浸潤。雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)輕微改變，心肌橫紋較清晰，間質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤。雷公藤多甙組和環(huán)孢素A組鏡下情況介于上述兩組之間(圖略)。

2.3小鼠外周血CD4+及CD8+T細(xì)胞比例

術(shù)后第5天，雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A組CD4+及CD8+T細(xì)胞占總細(xì)胞百分比明顯低于對照組及單獨用藥組百分比(P<0.05)。(見圖2A、B)

A．CD4+占總細(xì)胞數(shù)比例　B.CD8+占總細(xì)胞數(shù)比例

3討論

環(huán)孢素A屬于鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，通過抑制鈣調(diào)蛋白的活性，從而抑制T細(xì)胞的增殖活化，達(dá)到抑制免疫反應(yīng)的效果[7-9]。雷公藤多甙是從雷公藤根部提取出來的有效成分，具有抗炎、活血化瘀、抗菌、免疫抑制等功效[3,4]。作為免疫抑制劑，其可能通過抑制T細(xì)胞增殖而發(fā)揮作用[10,11]。

本研究中對環(huán)孢素A及雷公藤多甙設(shè)立獨立用藥組以及聯(lián)合用藥組，從小鼠腹腔心臟移植手術(shù)后移植心生存曲線可以看出，三組用藥組的移植心存活情況均明顯長于對照組。雖然單獨用藥組生存時間之間并無差異，但聯(lián)合用藥組的生存時間顯著高于單獨用藥組。從組織學(xué)形態(tài)也可看出，對照組炎性細(xì)胞浸潤明顯，心肌組織破壞嚴(yán)重；單獨用藥組情況好于對照組，但其之間差別并不明顯；聯(lián)合用藥組最優(yōu)，心肌細(xì)胞水腫較輕，間質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤。這說明了雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A的給藥方案增強了免疫抑制性，延長了移植物的存活時間。

通過檢測小鼠外周血T細(xì)胞比例發(fā)現(xiàn)，三組用藥組CD4+T細(xì)胞比例較對照組均明顯下降，其中聯(lián)合用藥組下降幅度最為顯著。對于CD8+T細(xì)胞比例的檢測發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢素A組CD8+T細(xì)胞比例下降的確不明顯，但雷公藤多甙組和聯(lián)合用藥組CD8+T細(xì)胞明顯降低，其中聯(lián)合用藥組下降幅度最為顯著。說明雷公藤多甙可以減少外周血中CD8+T細(xì)胞比例。雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A用藥可以顯著降低外周血中活化T細(xì)胞比例，減輕免疫排斥反應(yīng)，降低移植物排斥幾率。

雖然本研究觀察到雷公藤多甙聯(lián)合環(huán)孢素A可以抑制外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞，減輕T細(xì)胞介導(dǎo)免疫排斥反應(yīng)，降低移植物排斥幾率，但兩種藥物之間的明確機制以及起到協(xié)同作用時的最佳用量尚不明確，仍需進(jìn)一步研究探討。

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(收稿日期：2015-01-16)

文章編號：1007-4287(2015)12-2009-03

*通訊作者

基金項目：吉林省科技廳項目(20120934)；國家自然科學(xué)基金面上項目(81470975)；吉林省衛(wèi)生廳項目(2014Z042，2013Z002)