肝螺桿菌誘導(dǎo)不同品系小鼠慢性肝損傷與Th1/Th2細(xì)胞功能變化的分析

李紅艷,王　靜,盛傳倫,趙曉南

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

肝螺桿菌誘導(dǎo)不同品系小鼠慢性肝損傷與Th1/Th2細(xì)胞功能變化的分析

李紅艷,王靜,盛傳倫,趙曉南*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033)

摘要：目的觀察不同品系小鼠感染H.hepaticu后的肝臟病理損傷與Th1/Th2細(xì)胞功能的變化的關(guān)系。方法SPF級雄性BABL/c Cr、SCID/ Cr、C57BL/6 Cr小鼠接種 H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450菌液0.2 ml(1×108CUF/ml)，連續(xù)3次，每次間隔48 h，對照組灌飼等量的PBS。于末次接種H.hepaticus后第16周處死小鼠，留取血清和肝臟，一份肝組織行病理組織學(xué)檢查，另一份肝組織及血清應(yīng)用ELISA方法檢測細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5含量。結(jié)果H.hepaticus感染后16周時(shí)BALB/c Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于對照組(P<0.001)；BALB/c Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于SCID/ Cr、C57BL/6 Cr小鼠(P<0.001)；而SCID/ Cr小鼠、C57BL/6 Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；H.hepaticus感染后的各品系小鼠血清、肝臟組織中IL-4及IL-5含量與對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)；H.hepaticus感染后BALB/c Cr小鼠血清及肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量隨著肝臟病理評分的增高而增加(P<0.05；P<0.01)。結(jié)論H.hepaticus感染BALB/c Cr小鼠后誘導(dǎo)慢性肝損傷的程度與Th1細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α的水平呈正相關(guān)；具有免疫活性小鼠H.hepaticus感染后宿主免疫反應(yīng)是以Th1細(xì)胞為主的免疫反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：肝螺桿菌；不同品系小鼠；慢性肝損傷；Th1/Th2細(xì)胞功能

(ChinJLabDiagn,2015,19:2004)

1992年，美國國立癌癥研究所從發(fā)生了較高水平肝癌的雌性A/JCr小鼠的膽小管和膽囊中檢出一種螺旋狀細(xì)菌，命名為肝螺桿菌 (Helicobactel hepaticus,H.hepaticus)[1]。H.hepaticus不僅定植于多種敏感品系小鼠的下位腸道及肝膽系統(tǒng)，引起腸道炎癥性病變及慢性活動性肝炎，尤其是雄性的A/JCr小鼠，甚至導(dǎo)致肝細(xì)胞腺癌和腫瘤[2,3]。感染H.hepaticu的A/JCr小鼠肝臟血管周圍、肝實(shí)質(zhì)以及膽囊周圍出現(xiàn)多個(gè)單核細(xì)胞浸潤病灶，這些損傷提示在肝膽管系統(tǒng)可能存在針對H.hepaticus抗原細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[2]。研究發(fā)現(xiàn)H.hepaticus感染A/JCr小鼠的宿主反應(yīng)與人類感染H.pylori相類似，兩者所引起的病理改變均與細(xì)菌的持續(xù)定植以及顯著的免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥損傷相關(guān)[2,4]。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在螺桿菌的持續(xù)定植或促進(jìn)損傷方面的作用機(jī)制目前還沒有確定。H.pylori、H.felis的免疫反應(yīng)均為Th1樣反應(yīng)，因?yàn)槊庖呒?xì)胞產(chǎn)生IFN-γ多于IL-4[5-7]。Th細(xì)胞是能輔助T、B淋巴細(xì)胞應(yīng)答的功能亞群。生理狀態(tài)下，體內(nèi)Th1和Th2細(xì)胞可分別產(chǎn)生Th1型和Th2型細(xì)胞因子，并相互調(diào)節(jié)、相互制約，它們的失調(diào)與感染性疾病以及自身免疫性疾病相關(guān)。因此本研究針對H.hepaticu感染誘導(dǎo)出慢性肝損傷的不同品系小鼠，檢測其血清及肝臟組織中與Th1細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α含量以及與Th2細(xì)胞功能相關(guān)的細(xì)胞因子IL-4、IL-5 的含量，觀察不同品系小鼠感染H.hepaticu后的Th1/Th2細(xì)胞功能的變化及其與肝臟病理損傷的關(guān)系，為進(jìn)一步探討H.hepaticu致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株來源及培養(yǎng)

H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450購自美國國家標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)公司。凍存菌株經(jīng)布氏瓊脂培養(yǎng)基復(fù)蘇，于微需氧(5%O2，10%CO2，85%N2)、37℃、高濕度條件下培養(yǎng)7~10天，可疑菌落經(jīng)鑒定為H.hepaticus后進(jìn)行純培養(yǎng)2-3代，備用。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)

4-6周齡無特定病原菌(SPF)級雄性BABL/C、C57BL/6小鼠，購自吉林省高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SCID小鼠購自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動物有限公司。體重16-28克，分籠飼養(yǎng)，飼喂消毒的食物(食物根據(jù)小鼠體重限量供給)及水。

1.2實(shí)驗(yàn)分組與方法

1.2.1小鼠H.hepaticus感染模型的建立

已經(jīng)證實(shí)無H.hepaticus感染的SPF級雄性BABL/cCr、SCID/Cr、C57BL/6Cr小鼠各10只，按照文獻(xiàn)介紹方法接種H.hepaticus[2]。具體步驟如下：禁食12 h后接種制備好的H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450菌液0.2毫升(1×108CUF/ml)，對照組灌飼等量的PBS，連續(xù)3次，每次間隔48 h。

于最后一次接種H.hepaticus后第16周時(shí)，禁食12 h后處死小鼠，采用眼球摘除法取血0.3-0.5 ml，分離血清并于-80℃保存，統(tǒng)一行ELISA法檢測血清抗H.hepaticus-IgG抗體水平及細(xì)胞因子水平；隨機(jī)留取16周各組小鼠的肝臟、盲腸，用無菌生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，將組織加入適量生理鹽水搗碎，1000×g離心10 min，取上清液-80℃保存統(tǒng)一行細(xì)胞因子水平檢測。

1.2.2血清抗H.hepaticus-IgG抗體檢測

應(yīng)用H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株制備抗原包被ELISA反應(yīng)板，應(yīng)用ELISA法行小鼠血清中抗H.hepaticus抗體檢測。

①H.hepaticus超聲粉碎抗原的制備

選取穩(wěn)定傳代的H.hepaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC51450在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)7-10天，用無菌生理鹽水洗脫固體平板上的細(xì)菌，4℃、3 000 rmp離心10 min后棄上清，重新加入生理鹽水并用毛細(xì)細(xì)管吹打，懸浮后再離心，收集細(xì)菌。然后用小體積無菌生理鹽水懸浮，冰浴超聲粉碎10 min，4℃、12 000 rmp 離心20 min，收集上清。細(xì)菌殘?jiān)俪暦鬯?0 min，重復(fù)上述過程一次。合并兩次上清，測蛋白濃度，分裝后置-80℃保存，備用。

抗原濃度計(jì)算：超聲粉碎細(xì)菌抗原稀釋后，用U-341紫外可見分光光度計(jì)測260 nm和280 nm波長的吸光度值(A260、A280)，按下列公式計(jì)算濃度：

蛋白濃度(mg/ml)=(1.74×A280-0.75×A260)×稀釋倍數(shù)

②病理組織學(xué)分析

取小鼠肝臟組織以10%甲醛固定，石蠟切片，行HE染色供組織學(xué)診斷。病理組織學(xué)由兩人作雙盲檢查，采用Mohammadi 等[8]提出的評分標(biāo)準(zhǔn)，采用半定量計(jì)分方法：肝臟組織學(xué)損傷按炎癥細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞壞死、靜脈周圍卵圓細(xì)胞和膽小管增生、Ito細(xì)胞和增生枯否細(xì)胞以及多型性肝細(xì)胞這5種形態(tài)學(xué)變量分級：0分(正常)，1分(微小病變；病變累及≤5%)，2分(輕度：病變累及5-25%)，3分(中度：病變累及25-50%)和4分(重度：病變累及50%以上)。

③血清及組織中細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5檢測：ELISA檢測試劑盒購自上海銳聰生物技術(shù)有限公司，具體操作方法參照說明書。

④統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1不同品系小鼠H.hepaticus感染后16周時(shí)Th1細(xì)胞功能分析

為了分析不同品系小鼠H.hepaticus感染后與Th1細(xì)胞功能的關(guān)系，對H.hepaticus感染后16周時(shí)不同品系小鼠血清及肝臟組織中的IFN-γ、TNF-α含量進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示H.hepaticus感染后16周時(shí)BALB/cCr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于對照組(P<0.001)；BALB/cCr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯高于SCID/Cr、C57BL/6Cr小鼠(P<0.001)；而SCID/Cr小鼠、C57BL/6Cr小鼠血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　不同品系小鼠H.hepaticus感染后血清及肝組織中IFN-γ、TNF-α含量的比較

注：BALB/c Cr小鼠與對照組相比P<0.001；實(shí)驗(yàn)組BALB/c Cr小鼠血清及組織IFN-γ、TNF-α含量與C57BL/6 Cr及SCID/ Cr小鼠相比P<0.001

2.2不同品系小鼠H.hepaticus感染后16周時(shí)Th2細(xì)胞功能分析

H.hepaticus感染后的各品系小鼠血清、肝臟組織中IL-4及IL-5含量與對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)；各品系小鼠之間相比，也無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

表2　不同品系小鼠H.hepaticus感染后血清及肝組織中IL-4、IL-5含量的比較

各組之間比較P>0.05

2.3不同品系小鼠H.hepaticus感染肝臟病理評分與Th1細(xì)胞功能變化的關(guān)系

BALB/c Cr小鼠感染H.hepaticus后肝臟及血清中的IFN-γ、TNF-α含量明顯增高，為了進(jìn)一步探討H.hepaticus感染所誘導(dǎo)的慢性肝損傷與Th1細(xì)胞功能變化的關(guān)系，我們按照不同的肝臟病理損傷評分來觀察Th1細(xì)胞功能的變化。結(jié)果顯示H.hepaticus感染后BALB/c Cr小鼠血清及肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量隨著肝臟病理評分的增高而增加(P<0.05；P<0.01)。見圖1。

圖1　H.hepaticus感染BALB/c Cr小鼠血清及肝組織中IFN-γ、TNF-α含量與肝臟病理評分的關(guān)系

3討論

螺桿菌屬是一組革蘭氏陰性的微需氧螺旋狀細(xì)菌，研究顯示該菌屬與人或動物的一些疾病的發(fā)生具有一定的相關(guān)性，如胃腸道、肝膽疾病以及某些腫瘤等[9]。H.hepaticus最初是在A/JCr小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，可引起多種敏感品系小鼠發(fā)生慢性活動性肝炎，甚至肝細(xì)胞癌，而在免疫缺陷小鼠可導(dǎo)致炎癥性腸病[10]。本課題組應(yīng)用不同品系小鼠C57BL/6Cr、BALB/cCr以及SCID/Cr小鼠接種H.hepaticus，其中C57BL/6Cr、BALB/cCr小鼠具有免疫活性，而SCID/Cr小鼠為免疫缺陷小鼠，BALB/cCr及SCID/Cr小鼠感染H.hepaticus后均出現(xiàn)明顯的盲腸結(jié)腸炎癥及慢性活動性肝炎，而同樣具有免疫活性的C57BL/6Cr小鼠肝臟及腸道炎癥均較輕，因此探討H.hepaticus感染后宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)顯得十分重要。

本研究結(jié)果顯示BALB/c Cr小鼠感染H.hepaticus后血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量明顯升高；SCID/ Cr、C57BL/6 Cr小鼠感染H.hepaticus后血清、肝臟組織中IFN-γ、TNF-α含量雖較對照組有所增高，但兩者之間無顯著性差異，表明SCID/ Cr小鼠缺乏具有免疫活性小鼠感染H.hepaticus后所表現(xiàn)的重要的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答；而C57BL/6 Cr小鼠提示其感染H.hepaticus后病理損傷輕可能與其Th1細(xì)胞反應(yīng)不明顯有關(guān)。干擾素的過量產(chǎn)生以及低水平的IL-4、IL- 5與H.felis相關(guān)性胃炎小鼠模型是一致的[11]。自然殺傷細(xì)胞和Th1細(xì)胞均可產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ是一種炎癥因子，促進(jìn)IL-12的產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)幼稚T細(xì)胞向Th1細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換[12,13]。Th1介導(dǎo)的應(yīng)答中，IFN-γ釋放后誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化性細(xì)胞因子IP-10、Mig和MCP-1。IP-10、Mig作用于Th1細(xì)胞表面的趨化因子受體CXCR3，MCP-1可吸引單核吞噬細(xì)胞，從而使這些細(xì)胞聚集到炎癥部位，增強(qiáng)Th1型反應(yīng)。本研究中H.hepaticus感染BALB/c Cr小鼠后誘導(dǎo)慢性肝損傷的程度與Th1細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α的水平呈正相關(guān)，而以Th1為主的免疫反應(yīng)常和炎癥反應(yīng)及組織損傷有關(guān)，因此推測H.hepaticus感染的慢性肝損害的發(fā)生，伴隨著Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)的產(chǎn)生，該反應(yīng)加劇了感染的過程。

總之，本研究結(jié)果顯示H.hepaticus感染后引起明顯病理損傷的BALB/c Cr小鼠表現(xiàn)為Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，我們可以推測H.hepaticus感染引起病理損傷的結(jié)果至少部分原因來自宿主的免疫反應(yīng)及相關(guān)炎癥，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)對宿主來講可能是有害的。因此，將免疫策略轉(zhuǎn)向Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，這也許能為抑制細(xì)菌定植或減緩疾病惡化提供更多的保護(hù)。此外本實(shí)驗(yàn)也顯示SCID/ Cr小鼠感染H.hepaticus后可出現(xiàn)與BALB/c Cr小鼠相似的病理損傷，但其缺乏有效的宿主免疫應(yīng)答，這表明H.hepaticus感染小鼠導(dǎo)致病理損傷的發(fā)病機(jī)制不能完全歸因于宿主的免疫反應(yīng)，其致病機(jī)制是一個(gè)多因素相互作用的結(jié)果，還有待于進(jìn)一步研究探討。

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Analysis of chronic liver injury induced by Helicobacter hepaticus in mice of different strains and functional changes of Th1/Th2 cellsLIHong-yan,WANGJing，SHENGChuan-lun，etal.(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversty130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the relationship between liver pathological injury induced by H.hepaticus in mice of different strains and Th1/Th2 cell function.MethodsSPF-class male BABL/c Cr、SCID/Cr,C57BL/ 6 Cr mice inoculated H.hepaticus standard strain ATCC51450 0.2ml bacterial suspension (1×108CUF/ml)，for 3 times,each time interval of 48 hours，the control Group gavage the same amount of PBS.At last after Helicobacter hepaticus inoculation 16 weeks mice were killed，specimens from serum and liver，one liver tissue for histopathology；application of ELISA method to detect cytokines IFN-γ,TNF-α,IL-4,IL-5 contents of another liver tissue and serum.ResultsAfter H.hepaticus infection 16 weeks，IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in BALB /c Cr mice were significantly higher than the control group(P<0.001)；which IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in BALB /c Cr mice were significantly higher than SCID/ Cr mice and C57BL/6 Cr mice (P<0.001)；Compared with the control group，the IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in SCID/ Cr mice and C57BL/6 Cr mice after H.hepaticus infection were no significant difference (P>0.05)；Compared with the control group，the IL-4,IL-5 contents of serum and liver tissue in all strains of mice after H.hepaticus infection were no significant difference (P>0.05)；IFN-γ,TNF-α contents of serum and liver tissue in H.hepaticus infected BALB/c Cr mice were increased with liver pathology scores increased (P<0.05；P<0.01).ConclusionThe degree of chronic liver injury induced by H.hepaticus infection in BALB/c Cr mice were positively correlated with IFN-γ,TNF-α levels of Th1 cytokines；Host immune response after immunocompetent mice infect H.hepaticus is a Th1-based immune response.

Key words:Helicobacter hepaticus; different strains of mice; chronic liver damage；Th1/Th2 cell function

(收稿日期：2015-01-19)

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

中圖分類號：R392

文章編號：1007-4287(2015)12-2004-05

*通訊作者